氨基酸对动物的生长、神经系统的发育及动物体内营养
物质的正常代谢都有重要的作用,而且蛋白质是动物生长必
需的营养物质,是评价饲料营养成分的一种重要物质,而氨
基酸是构成蛋白质的基本单位,所以氨基酸的种类和含量也
就是评价饲料质量的根本依据,从而准确检测氨基酸的含量
和种类具有重要意义。柱后衍生的方法,虽然准确性高,但
是耗时长、灵敏度低,所以本文采用柱前衍生的方法以缩
短分析时间,增加灵敏度。同时该方法得到的氨基酸衍生物
在 -20℃ 可保存数月,克服了柱前衍生法衍生物不稳定的缺
点,另外该方法准确性高,用标准品做未知样品进行检测,
检测的含量与标准品的标示值非常接近。
1. 样品前处理
酸水解法:准确称取一定量的样品,使样品氨基酸总量
在 50~75 mg 范围内,置于 20~30 mL 安瓿瓶中,加入 10 mL
含 0.1% 苯酚的 6 mol/L 盐酸,振摇使样品溶解或者是样品
均匀分散在溶液中,将安瓿瓶置于 -20℃ 冰箱中冷冻3~5 分
钟,充氮后用喷灯熔封,然后置于 110±1℃ 烘箱中水解 24
小时,取出冷却,取水溶液 1 mL,置于浓缩管中用浓缩仪
浓缩至干,加入 1 mL 的 0.1 mol/L 稀盐酸溶解,用 0.45 µm
滤器过滤后,取清液贮存于冰箱中,供衍生使用。
2. 衍生方法
准确量取水解后溶液及氨基酸标准品 200 µL,分别置
于 1.5 mL 离心管中,往每支离心管中准确加入正亮氨酸内
标 50 µL,然后分别加入三乙胺乙腈溶液 100 µL 和异硫氰
酸苯酯乙腈溶液 100 µL,摇匀室温静置衍生 1 小时。衍生
结束后分别加入 400 µL 正己烷,振摇并静置 10 min,取下
层溶液 200 µL 并用水稀释到 1 mL,混合均匀后用 0.45 µm
针式过滤器过滤即可。
3. 检测方法
3.1 溶液配制
流动相 A:称取 15.2 g 无水乙酸钠,加水 1850 mL,溶
解后用冰醋酸调 pH 值到 6.5,然后加乙腈溶液 140 mL,混
合均匀并用 0.45 µm 滤器过滤
流动相 B:80% 乙腈水溶液
3.2 高效液相检测条件
仪器:LC-10F 高效液相色谱仪
色谱柱:Venusil® AA 氨基酸分析专用柱
4.6×250 mm,5 µm,100 Å
流 速:1 mL/min;进样量:10 µL
检测波长:254 nm;柱 温:40℃
检测梯度如表1
4. 实验结果与讨论
4.1 液相条件的建立
样品中氨基酸含量比较低,而且直接检测溶剂效应较
大,经过衍生后直接检测样品中的氨基酸不能完全分离,本
文通过用水稀释衍生溶液的方法降低检测中的溶剂效应,并
且经过优化流动相梯度使 18 种氨基酸得到良好的分离。
但是实际检测过程中相同的检测条件下,仪器不同,分
离效果差别较大,有的甚至都完全分不开,为此本文还开
发了一种基础检测条件,可以根据仪器的自身特点,稍加
调整流动相的比例即可使 18 种氨基酸得到较好的分离。基
础检测条件如表2 所示。
4.2 检测方法的稳定性、线性及准确性
氨基酸标准品按照 2 方法衍生后,相同的条件下连续重
复进样 6 次,计算相对标准偏差,结果如表3 所示。由结果
可知该方法比较稳定,可以用来检测氨基酸样品,其实验谱
图如图1 所示。
根据仪器对各个物质的响应情况,将氨基酸标准溶液分
别稀释成 2.5 µmol/mL (胱氨酸为 1.25 µmol/mL)、1.25 µmol/
mL (胱氨酸为 0.625 µmol/mL)、0.5 µmol/mL (胱氨酸为 0.25
µmol/mL)、0.25 µmol/mL (胱氨酸为 0.125 µmol/mL)、0.125
µmol/mL (胱氨酸为 0.0625 µmol/mL) 5个浓度,然后按照 2 的
衍生方法同时衍生处理,样品经稀释过滤后在相同的实验条
件下进样,依据进样浓度X (µmol/mL)为横坐标,峰面积Y
为纵坐标进行线性回归,根据各个物质峰高、噪音,遵循 S/
N=3 计算出最低检出限,回归方程及检出限见表3。可见,
在选定的液相色谱条件下氨基酸标准溶液的响应与浓度呈良
好的线性关系。
为了验证建立方法的准确性,本文用 Sigma 氨基酸标准
品为样品,以博纳艾杰尔科技的标准品为标准品通过相同的
方法衍生和检测得出检测值与标示值之间的偏差,除胱氨酸
外,偏差均小于 3%,接近标准品的标示值,证明该方法准
确性高,检测效果稳定。实验结果如表4。
因为半胱氨酸在碱性环境下能够转化成胱氨酸,所以经
碱水解后胱氨酸的含量不稳定,此外有时两个半胱氨酸残基会
发生二硫键交联,经异硫氰酸苯酯衍生后的胱氨酸也不稳定,
非常容易分解,所以胱氨酸的相关系数和偏差都比较大。
4.3 样品检测结果
按照上述方法检测处理后的饲料样品可得色谱图如图
2、图3,通过单点校正法可以得出样品1和样品2 中含有标准
品中的 18 种氨基酸。
样品中的 18 种氨基酸均能得到良好的分离,这说明在有
基质干扰的情况下本文建立的这种方法同样适用,而且样品
连续进样重复性非常好,未出现样品变质或者峰形变差的现
象,证明本文建立的方法在有基质干扰的情况下也同样克服
了衍生氨基酸容易分解的问题。
4.4 实验结论
按照上述实验条件,可以准确检测饲料样品中 18 种氨基
酸,同时检测的灵敏度及线性都能满足检测的要求,而且本
方法准确性高,与样品中含有氨基酸的真值偏差非常小,所
以该方法可以准确的检测饲料样品中的氨基酸。
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