【飞诺美色谱】饲料中18种氨基酸的测定（柱前衍生HPLC法）

氨基酸对动物的生长、神经系统的发育及动物体内营养

物质的正常代谢都有重要的作用，而且蛋白质是动物生长必

需的营养物质，是评价饲料营养成分的一种重要物质，而氨

基酸是构成蛋白质的基本单位，所以氨基酸的种类和含量也

就是评价饲料质量的根本依据，从而准确检测氨基酸的含量

和种类具有重要意义。柱后衍生的方法，虽然准确性高，但

是耗时长、灵敏度低，所以本文采用柱前衍生的方法以缩

短分析时间，增加灵敏度。同时该方法得到的氨基酸衍生物

在 -20℃ 可保存数月，克服了柱前衍生法衍生物不稳定的缺

点，另外该方法准确性高，用标准品做未知样品进行检测，

检测的含量与标准品的标示值非常接近。

1. 样品前处理

酸水解法：准确称取一定量的样品，使样品氨基酸总量

在 50~75 mg 范围内，置于 20~30 mL 安瓿瓶中，加入 10 mL

含 0.1% 苯酚的 6 mol/L 盐酸，振摇使样品溶解或者是样品

均匀分散在溶液中，将安瓿瓶置于 -20℃ 冰箱中冷冻3~5 分

钟，充氮后用喷灯熔封，然后置于 110±1℃ 烘箱中水解 24

小时，取出冷却，取水溶液 1 mL，置于浓缩管中用浓缩仪

浓缩至干，加入 1 mL 的 0.1 mol/L 稀盐酸溶解，用 0.45 µm

滤器过滤后，取清液贮存于冰箱中，供衍生使用。

2. 衍生方法

准确量取水解后溶液及氨基酸标准品 200 µL，分别置

于 1.5 mL 离心管中，往每支离心管中准确加入正亮氨酸内

标 50 µL，然后分别加入三乙胺乙腈溶液 100 µL 和异硫氰

酸苯酯乙腈溶液 100 µL，摇匀室温静置衍生 1 小时。衍生

结束后分别加入 400 µL 正己烷，振摇并静置 10 min，取下

层溶液 200 µL 并用水稀释到 1 mL，混合均匀后用 0.45 µm

针式过滤器过滤即可。

3. 检测方法

3.1 溶液配制

流动相 A：称取 15.2 g 无水乙酸钠，加水 1850 mL，溶

解后用冰醋酸调 pH 值到 6.5，然后加乙腈溶液 140 mL，混

合均匀并用 0.45 µm 滤器过滤

流动相 B：80% 乙腈水溶液

3.2 高效液相检测条件

仪器：LC-10F 高效液相色谱仪

色谱柱：Venusil® AA 氨基酸分析专用柱

4.6×250 mm，5 µm，100 Å

流 速：1 mL/min；进样量：10 µL

检测波长：254 nm；柱 温：40℃

检测梯度如表1

4. 实验结果与讨论

4.1 液相条件的建立

样品中氨基酸含量比较低，而且直接检测溶剂效应较

大，经过衍生后直接检测样品中的氨基酸不能完全分离，本

文通过用水稀释衍生溶液的方法降低检测中的溶剂效应，并

且经过优化流动相梯度使 18 种氨基酸得到良好的分离。

但是实际检测过程中相同的检测条件下，仪器不同，分

离效果差别较大，有的甚至都完全分不开，为此本文还开

发了一种基础检测条件，可以根据仪器的自身特点，稍加

调整流动相的比例即可使 18 种氨基酸得到较好的分离。基

础检测条件如表2 所示。

4.2 检测方法的稳定性、线性及准确性

氨基酸标准品按照 2 方法衍生后，相同的条件下连续重

复进样 6 次，计算相对标准偏差，结果如表3 所示。由结果

可知该方法比较稳定，可以用来检测氨基酸样品，其实验谱

图如图1 所示。

根据仪器对各个物质的响应情况，将氨基酸标准溶液分

别稀释成 2.5 µmol/mL (胱氨酸为 1.25 µmol/mL)、1.25 µmol/

mL (胱氨酸为 0.625 µmol/mL)、0.5 µmol/mL (胱氨酸为 0.25

µmol/mL)、0.25 µmol/mL (胱氨酸为 0.125 µmol/mL)、0.125

µmol/mL (胱氨酸为 0.0625 µmol/mL) 5个浓度，然后按照 2 的

衍生方法同时衍生处理，样品经稀释过滤后在相同的实验条

件下进样，依据进样浓度X (µmol/mL)为横坐标，峰面积Y

为纵坐标进行线性回归，根据各个物质峰高、噪音，遵循 S/

N=3 计算出最低检出限，回归方程及检出限见表3。可见，

在选定的液相色谱条件下氨基酸标准溶液的响应与浓度呈良

好的线性关系。

为了验证建立方法的准确性，本文用 Sigma 氨基酸标准

品为样品，以博纳艾杰尔科技的标准品为标准品通过相同的

方法衍生和检测得出检测值与标示值之间的偏差，除胱氨酸

外，偏差均小于 3%，接近标准品的标示值，证明该方法准

确性高，检测效果稳定。实验结果如表4。

因为半胱氨酸在碱性环境下能够转化成胱氨酸，所以经

碱水解后胱氨酸的含量不稳定，此外有时两个半胱氨酸残基会

发生二硫键交联，经异硫氰酸苯酯衍生后的胱氨酸也不稳定，

非常容易分解，所以胱氨酸的相关系数和偏差都比较大。

4.3 样品检测结果

按照上述方法检测处理后的饲料样品可得色谱图如图

2、图3，通过单点校正法可以得出样品1和样品2 中含有标准

品中的 18 种氨基酸。

样品中的 18 种氨基酸均能得到良好的分离，这说明在有

基质干扰的情况下本文建立的这种方法同样适用，而且样品

连续进样重复性非常好，未出现样品变质或者峰形变差的现

象，证明本文建立的方法在有基质干扰的情况下也同样克服

了衍生氨基酸容易分解的问题。

4.4 实验结论

按照上述实验条件，可以准确检测饲料样品中 18 种氨基

酸，同时检测的灵敏度及线性都能满足检测的要求，而且本

方法准确性高，与样品中含有氨基酸的真值偏差非常小，所

以该方法可以准确的检测饲料样品中的氨基酸。

5. 订货信息