【飞诺美色谱】食品中八种人工着色剂的测定 HPLC 法

人工合成着色剂又称人工合成色素，常以苯、甲苯等 为原料，先制备色素中间体，再将一种或两种中间体进行 磺化、偶合、缩合和偶氮化等化学反应而制成。《食品中 合成着色剂的测定》(GB/T 5009.35-2003)，采用聚酰胺吸附 食品中的人工合成着色剂，并用乙醇胺溶液进行洗脱。聚 酰胺对合成色素的吸附能力会受到温度的影响，实验时需 对样品和淋洗液做加热处理，而且乙醇胺浓缩所需时间过 长，此方法不适合大批量样品同时处理，且不易做自动化 方法移植。 大多数人工合成着色剂均具有苯磺酸钠结构，本实验 选用Cleanert® PWAX 混合型弱阴离子交换柱，用以吸附食 品中的合成着色剂，选用氨化甲醇洗脱，浓缩时间短，适 用于大批量样品的同时检测。

1. 样品溶液的配置 a) 乙酸铵溶液 (0.02 mol/L)：称取 1.54 g 乙酸铵，加水 溶解并稀释至 1000 mL； b) 甲醇/甲酸 (6+4) 溶液：量取甲醇 60 mL，甲酸 40  mL，混匀； c) 柠檬酸溶液：称取 20 g 柠檬酸，加水至 100 mL 溶 解，混匀； d) 提取液a：量取无水乙醇 70 mL，氨水溶液 20 mL、 水 10 mL，混匀； e) 水 (pH为6.0)：水加柠檬酸溶液调节 pH为6.0；2. 样品提取 a) 饮料类样品：称取 10 g 样品放入 100 mL 烧杯中，含 二氧化碳的样品加热去除二氧化碳； b) 配制酒类：称取 10 g 样品放入 100 mL 小烧杯中，加 热去除乙醇； c) 液体调味料：称取 10 g 样品放入 100 mL 小烧杯中， 若试样 pH 值偏高，用柠檬酸水溶液调节 pH 至 6 左右； d) 固体调味料：称取 2 g 样品放入 100 mL 小烧杯中， 加入 10 mL 1% 氨水溶液，涡旋提取 1 min，4000 r/min 离心 5 min，重复提取至提取液无色，合并上清液，用柠檬酸水 溶液调节 pH 至 6 左右作为待净化液； e) 酱料类：称取 2 g 样品，加入 20 mL 石油醚，涡旋 混合1 min，5000 r/min 离心 5 min，弃去石油醚上清液，残 渣吹干，加入 10 mL 1% 氨水溶液，涡旋提取 1 min，4000r/ min 离心 5 min，重复提取至提取液无色，合并上清液，用 柠檬酸水溶液调节 pH 至 6 左右作为待净化液； f) 果冻、水果罐头：称取已均质样品 2 g，装入 50 mL  离心管中，加入 5 mL 提取液a涡旋 1 min，4000r/min 离心 5  min，重复提取至提取液无色，合并上清液置于 80℃水浴中 浓缩至 2 mL，水洗转移至 10 mL 比色管中，用水定容(若试 样 pH 偏高，用柠檬酸水溶液调节 pH 至 6 左右)； g) 肉制品：称取已均质样品 2 g，装入 50 mL 离心管 中，加入 20 mL 石油醚，涡旋混合 1 min，4000 r/min 离心 5 min，弃去石油醚上清液。残渣吹干，加入 5 mL 提取液 a涡旋 1 min，4000 r/min 离心 5 min，重复提取至提取液无 色，合并上清液置于 80℃ 水浴中浓缩至 2 mL，水洗转移至 10 mL 比色管中，用水定容 (若试样 pH 偏高，用柠檬酸水 溶液调节 pH 至 6 左右)转移至卓睿全自动固相萃取仪上样 管中，待净化。 3. 固相萃取柱净化 SPE小柱：Cleanert® PWAX (150 mg/6 mL) Cleanert® PA (1 g/6 mL) 取以上两种固相萃取柱及上述提取液至 Qdaura® 卓睿全 自动固相萃取仪中，完成 SPE 净化过程：6 mL 甲醇，6 mL 水 (pH 值 6 ~ 7)； 加样 10 mL； 6 mL 水 (pH为4)、6 mL 甲醇-甲酸(6：4)、6 mL 水(pH 值 6 ~ 7) 淋洗； 通入空气吹干小柱 5 min，6 mL 2% 氨化甲醇洗脱并接 收，收集液于 50℃ 氮气吹干，用 1 mL 水定容，过 0.45 µm 水 系滤器过滤，待测。

4. 实验条件 色谱柱：Venusil® XBP C18(L) 5µm 4.6 × 150 mm； 流 速：1.0 mL /min； 进样量：20 µL；波 长：254 nm； 梯 度：

5. 实验结果 5.1 Cleanert® PWAX SPE 柱添加回收实验 通过对不同基质样品的加标实验，对上述检测方法进 行验证，结果见下表：

5.2 赤藓红净化方法优化 赤藓红为苯甲酸钠结构，相对其他苯磺酸钠结构的着色 剂，在 SPE 小柱上保留较弱，国标《GB5009.35-2003》中赤 藓红的前处理方法是和其他色素不一样的，采用的是液液萃 取的方法。如按照 2.2 的净化方法操作，在淋洗阶段赤藓红 将全部被洗脱下来。通过方法优化，最终淋洗方法确定为 6  mL 水 (pH 值 6 ~ 7)、6 mL甲醇，选用 Cleanert® PWAX (150  mg/6 mL)，其他条件不变，可满足同时处理9种着色剂的实 验要求。 注意事项 1) 若提取液呈碱性，在上样之前要将其pH值调节至6左右，保证小 柱对合成着色剂有良好地吸附； 2) 若样品酒精度过高，建议在上样前对样品进行除醇处理； 3) SPE小柱净化过程中，要注意对流速的控制，建议控制在1mL/ min左右； 4) 洗脱液氮吹复溶后，应选用水系滤膜过滤，防止因滤膜吸附造 成样品的损失，建议选用Hydrophilic PTFE 滤头。 5.3 结论 实验结果表明，Cleanert® PWAX 或者 Cleanert® PA 聚 酰胺柱和 Venusil® XBP C18(L) 液相色谱柱可以用于食品中 的合成着色剂的检测，该方法快速、准确。Cleanert® PWAX  SPE 小柱可同时处理9种着色剂，Cleanert® PA 聚酰胺柱可 同时处理 8 种着色剂。