【飞诺美色谱】奶粉中双氰胺的检测方法

北京时间 1 月 25 日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写 DICY 或 DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。

针对婴幼儿奶粉中基质复杂的特点，本方法加大了净化材料的用量，以获得了更好的净化效果。采用天津博纳艾杰尔科技的新一代的 Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管（500 mg/15 mL，货号：MS-SQA02）和 Venusil® HILIC 液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的 MAS-QuEChERS 快速前处理方法和 LC-UV 以及 LC-MS/MS 检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。

双氰胺标准品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），新一代 Cleanert ® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil ® HILIC 液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。

样品：新西兰 婴儿配方奶粉（0~6 个月）

1.2 实验步骤

称取 1 g 试样于 50 mL 具塞离心管中，加 2 mL 水，涡旋 30 s，加 2 mL 乙腈涡旋30 s。再往现有的提取液中加 2 mL 乙腈，重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复 2次，得到共计约 10 mL 的提取液。以 4000 r/min 离心 5 min，将全部上清液加入新一代Cleanert® MAS-QuChERS 管中（500 mg/15 mL），将 MAS 管上下晃动 30 s，然后涡旋30 s 后，8000 r/min 离心 5 min，取全部上清液（约 10 mL）于玻璃试管中，50℃下氮气吹干，加入 1 mL 乙腈-水混合溶液（97:3）复溶，过 0.22 μm 微孔滤膜，待测。

注：

1. 做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂，防止加标瞬间发生蛋白沉淀；

2. 乙腈提取分 4 次，为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快，影响提取效果；

3. 净化液氮气吹干后，如发现有少量油脂，可 采用 1 mL 乙腈：水（97:3 ）混合溶液复溶，之后加入 1 mL 正己烷（色谱纯）液液萃取，取下层溶液过 0.22 μm 微孔滤膜，进样检测。

1.3 实验条件

1.3.1 高效液相色谱法（HPLC 法）：

色谱柱：Venusil® HILIC（5 μm，100 Å，4.6 × 250mm）；

流动相： 10 mmol/L 乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=15: 85；

波长：220 nm；进样量：10 µL；柱温：30℃；流速：0.8 mL/min。

1.3.2 LC-MS/MS 法：

（1）色谱条件：

色谱柱：Venusil® HILIC（ 5 μm，100 Å，2.1 × 150mm）；

流动相：A：0.5 mmol/L 乙酸铵（pH=4.0）

B：乙腈；

进样量：10 µL；柱温：30℃；流速：0.3 mL/min。

* 备注 ：本文曾尝试过多种 C18 色谱柱，对双氰胺没有保留，需要使用离子对试剂，但是无法用于 LC-MS/MS ；也曾尝试过 MERCK ZIC-HILIC 柱，但是得到双氰胺的峰面积偏差较大，分析原因是其具有阳离子交换基团，对双氰胺有不稳定的死吸附。最后确定使用键合 丙基酰胺的 VenusilHILIC 柱，以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留。

（2）质谱条件：

质谱仪：AB SCIEX API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；CAD：8.00；CUR：20.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：600.00。

注：带“____”的监测离子对为定量离子对。

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱法：

2.1.1 双氰胺的液相色谱图

2.1.2 实际样品基质加标的线性关系和检出限

准确称取双氰胺标准品 50mg 于 50mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液；

分别称取 1g 奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为 0.5µg/g，1µg/g，2µg/g，5.0µg/mL 和 10µg/g 的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述色谱条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表 4：

2.1.3 准确度和精密度

选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表 5

2.2 LC-MS/MS 法

2.2.1 双氰胺的 LC-MS/MS 图

图 4 双氰胺 10 ng/mL 标准溶液质谱图

2.2.2 实际样品基质加标的线性关系和检出限

准确称取双氰胺标准品 50 mg 于 50 mL 容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液；

分别称取1 g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为5 ng/mL，10 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL 和 200 ng/mL 的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述液质条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表 6：

2.2.3 准确度和精密度

选取市售某婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表 7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。

图 7 婴幼儿奶粉空白质谱图

3. 订货指南