SEC-MALS和AF4-MALS在高分子量肺炎双球菌结合疫苗表征中的应用

SEC-MALS和AF4-MALS在高分子量肺炎双球菌结合疫苗表征中的应用

前言：

肺炎双球菌感染会造成严重的肺炎球菌疾病和其他医学并发症，目前人们已经开发了一系列以多糖为基础的疫苗制剂来预防细菌感染。包括肺炎双球菌多糖型疫苗(PPSV)- PNEUMOVAX®，以及PREVNAR®和VAXNEUVANCE™等多糖蛋白结合型疫苗，在90多种肺炎球菌血清型中，血清型1 (ST-1)和血清型4 (ST-4)是肺炎球菌感染(IPD)的两种主要类型。

开发针对这些血清型的新型多价PCV需要对疫苗中每个单价偶联物(MVC)深入表征。进一步了解和表征这些高分子量(Mw)多糖蛋白偶联物，可采用尺寸排阻色谱与18角度激光光散射联用技术(SEC-MALS)或非对称场流与18角度激光光散射联用技术(FFF-MALS)。两种正交分离机制的MALS分析有助于揭示每个结合物的构象的异构性和聚集态。

样品与分析方法

样品：ST-1 MVCs和ST-4 MVCs均由疫苗工艺开发部门合成[1]，仅供研究使用

方法及仪器：

SEC-MALS联用: 多角度激光(MALS)和示差折光检测器(RI)( DAWN® and Optilab®, Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA, USA)与紫外-可见二极管阵列检测器(UV)联用顺序为：SEC-UV-MALS-RI。

AF4-MALS联用：AF4-UV-MALS-RI

ASTRA软件(Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA, USA): 使用Wyatt蛋白复合物分析方法。

结果与讨论

1. 高分子量MVCs的SEC测试

图 1 ST-1 MVC色谱图:(a) SEC-MALS;(b) AF4-MALS。((b)中的虚线表示聚焦后的流道压力变化)。

表1 MVCs经SEC-MALS分离的Mw和Rz结果(Zimm一阶方程)

表2 肺炎双球菌多糖前体经SEC-MALS分离的Mw和Rz结果

在之前报道中SEC方法在高分子量的MVCs测试开发及优化过程中表现出良好的精准性和一致性(色谱图如图1a所示)，表1中MVCs标准样测试结果显示出良好的一致性，然而复合物ST-1 MVC和ST-4 MVC的分子量随着注射体积的增加而明显上升(表1的ST-1 MVC和ST-4 MVC)，相应的多糖前体则并未观察到这种变化(表2)。

表3使用Zimm和Berry模型对MVC分子量结果的影响对比

2阶Berry 方程同样适用于MVC复合物分析，通过Berry拟合方程进一步降低拟合误差，从表3我们可以观察到Berry方程降低了进样体积差异带来的分子量结果误差，但并未消除分子量对进样量的依赖性。基于上述结果，我们猜测高荷电载体蛋白与带荷电的ST-1和ST-4多糖的结合具有一定的分子相互作用（例如聚电解质共轭物种之间的自缔合）。在高进样量下，SEC柱上的样品浓度更高，更多的缔合作用导致多角度检测器得到更高的分子量，相反，低进样量下的缔合作用降低导致分子量较低。我们同样观察到SEC的非理想洗脱，多分散聚合物的分子量应该随着洗脱时间的延长而降低。然而，我们观察到ST-1和ST-4的Mw曲线在约9分钟时上升(如图2a,b所示)，这是非理想的分离现象，这种现象通常在高Mw和支化聚合物中观察到。因此我们需要进一步通过AF4-MALS来探究这两种高Mw的MVCs.

图2.  SEC-MALS上的MVCMw分布:(a) ST-1 MVC; (b) ST-4MVC。每一种结合体在蓝色的痕迹中被洗脱成一个峰。共轭摩尔质量分布显示为钩形红线。

2. 高分子量MVCs的AF4测试

我们对AF4-MALS方法进行开发和优化（如图1b.所示），采用二阶Berry模型对ST-1和ST-4 MVCs同样体积进样量进行分析。与SEC相比较，AF4的分离方法相较于SEC更加温和，且不受限于固定相的剪切和吸附作用，因此在图3a, b中分子量随洗脱时间呈现良好的递增现象。由表四的数据表明，AF4-MALS所测Mw和Rz都比SEC-MALS结果大(对比表1和表4)，由于AF4-MALS温和的分离条件下样品的自缔合作用得以保留，也正因为这种自缔合作用，我们在SEC-MALS上观察到具有浓度依赖性的Mw结果。而在ST-4 MVC样本中观察到不光滑的峰尖，并且重现性较ST-1差，我们认为是分离过程中出现的”粘指”效应(当样品粘度高于流动相粘度时，就会发生粘性指压现象)。

图3.AF4-MALS的MVC分子量分布：(a) ST-1 MVC; (b) ST-4 MVC. 蓝线表示洗脱峰，红线表示每个峰片段的分子量分布

表4. 由AF4-MALS测试所得MVC的Mw和Rz值

3. SEC-MALS和AF4-MALS的结果讨论

我们发现AF4-MALS结果是相应SEC-MALS的两倍(表3和4)，众所周知，对如此高分子量的聚电解质样品的Mw测定具有挑战性，其分子量可能会因非均相分布、自缔合状态和构象等问题而变得复杂。AF4作为一种温和的分离技术，有助于维持或保留复合物的原始状态，因此从AF4流道中分离出更多的聚集体获得更高的分子量结果，而SEC-MALS结果表明存在较少的聚集体。使用两种正交的表征分子量的方法，不仅能够为我们揭示复合物的关键属性及分布信息，并且可以促进配方的开发及优化。

总结

蛋白质多糖疫苗可有效对抗致命性的细菌感染，因此对其分子量的精准分析具有重要意义，然而受限于高带电荷物质的自相互作用/聚集行为的影响， SEC-MALS方法展现出一定的准确性和可靠性。但是在温和分离条件下操作的AF4-MALS能更好地展示复合物的原始状态。SEC-MALS和AF4-MALS的正交分析进一步揭示复合物的生物物理状态，更好地理解分子量/粒径分布和分子间相互作用。正交分析方法针对研究和开发过程的优化和理解是非常有用的工具，同样这种正交策略应该在许多其他复杂的疫苗、药品和材料产品中得到广泛应用。

编译：怀雅特ZZX

时间：2022年10月27日

关键词Key words：肺炎双球菌多糖蛋白(MVCs) 、自缔合作用、重均分子量、多角度激光光散射、Berry 方程

分类：SEC-MALS 和AF4-MALS

Reference

（1） Deng, J. Z.; Lancaster, C.; Winters, M.A.; Phillips, K.M.; Zhuang, P.; Ha, S. Multi-attribute Characterization of Pneumococcal Conjugate Vaccine by Size-exclusion Chromatography Coupled with UV-MALS-RI Detections. Vaccine. 2022, 40, 1464–1471.

（2） Deng, J. Z.; Lin, J.; Chen, M.; Zhuang, P. Characterization of High Molecular Weight Pneumococcal Conjugate by SEC-MALS and AF4-MALS. Polymers. 2022, 14(18), 3769.