全新系列色谱柱助力SEC-MALS系统在治疗性单抗、生物相似药以及腺相关病毒分析表征中的应用

Summary

众所周知，SEC-MALS已经逐渐成为生物制药领域一种不可或缺的、关键性的、高效且可靠的分析表征手段。其中最经典配置为Waters的Arc™ Premier HPLC与Wyatt的多角度激光光散射仪DAWN™、干涉型示差折光检测器Optilab™(dn/dc仪)联用，在此基础上再搭配使用XBridge™ Premier系列尺寸排阻色谱柱，可以极大程度地拓展其在生物医药方面的应用。本应用文摘旨在介绍SEC-MALS与XBridge Premier Protein、XBridge Premier GTx BEH SEC色谱柱联用后可直接定量表征治疗性单抗mAbs、生物相似药和腺相关病毒粒子AAVs等的关键质量属性。

Introduction

SEC-MALS（由尺寸排阻分离色谱SEC、多角度激光光散射仪DAWN™、紫外检测器UV和干涉型示差折光检测器Optilab™联用组成）作为一种简单、稳健的方法早已被广泛用于定性和定量蛋白和其他生物制药的各种关键质量属性，例如，绝对摩尔质量Mw、聚集体、纯度、偶联物、空包率及有效载荷等属性。SEC-MALS系统是一种无试剂、可实现自动化且符合QA/QC要求的实验室标准表征工具。

若想达到对SEC-MALS系统的极致应用体验，找到最佳分离效果的色谱柱以及最优色谱条件是至关重要的。其中XBridge Premier色谱柱是最佳选择之一，并且实验证明该色谱柱在色谱条件优化方面无需过多消耗时间。除此之外，与其他硅基填料蛋白柱在分离蛋白和AAVs相比，具有更高的分辨率。

Materials and Methods

Instrumentation

SEC尺寸排阻分离色谱系统：Waters Arc Premier HPLC系统，其中包括2998 PDA UV检测器（可同时采集280nm、260nm）；

多角度激光光散射仪MALS：DAWN，内置在线动态激光光散射模块WyattQELS；

干涉型示差折光检测器dRI（dn/dc仪）：Optilab

专用数据处理及分析软件：ASTRA™ software.

Figure 1. SEC-MALS系统：HPLC模块(泵、自动进样器和PDA)、多角度激光光散射仪DANW和干涉型示差折光检测器Optilab.

Columns

Waters XBridge Premier系列色谱柱有两大技术优势：一方面它具有Waters MaxPeak™ Premier高性能表面（保护对金属敏感的分析物）和2.5 µm BEH- PEO材质填料，与传统5um硅基色谱柱相比，它更适合SEC-MALS系统。

Proteins

色谱柱1：XBridge Premier Protein SEC column，250 Å，7.8 mm x300 mm

色谱柱2：Wyatt Technology的硅基SEC柱，300 Å，7.8 mm x 300 mm

流动相：Dulbecco’s PBS (10 mM Na2 HPO4, 1.8 mM KH2 PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 3.1 mM NaN3  pH 6.7).

流速：0.5 mL/min

样品：

•    Herceptin (trastuzumab): 10 µL/21 mg/mL；

•    Kanjinti (trastuzumab biosimilar): 10 µL/21mg/mL；

•    Pertactin: 50 µL at 0.5 mg/mL；

•    UT antibody: 50 µL at 1.0 mg/mL

感谢由德克萨斯大学奥斯汀分校提供的Pertactin和UT antibody

AAV

样品：empty和full AAV8样品。

色谱柱：分别使用XBridge Premier GTx BEH SEC column 450 Å, 7.8 mm x 300 mm或者Wyatt Technology AAV column, 500 Å, 4.6 mm x 300 mm分离。

流动相：根据Wyatt’s AAV SOP Guidance Manual 配制，流速设定0.5 mL/min，详细分析方法详见Wyatt的AAV SOP Guidance Manual（ASTRA软件中Viral Vector Analysis Method）

Results and Discussion

平台色谱柱技术极简化了液相色谱方法开发

非理想色谱行为产生于样品和色谱柱之间，由于非位阻相互作用而产生的次级相互作用，可能会导致相对于标准品洗脱时间的变化、色谱峰拖尾以及其他不利影响。这些液相色谱中的现象会导致传统分析型SEC分析的不确定性，可能需要投入大量的时间和资源来优化方法从而改善色谱分离效果。如本文所述，只需使用XBridge Premier Protein SEC色谱柱替代通用硅基SEC色谱柱就可以极大地改善的分离效果。

Pertactin是Bordetella pertussis细菌的一种高度免疫原性的毒性因子，这种细菌引起百日咳，并可用于生产非细胞(组成)的百日咳疫苗。如图2（上）所示，由于二次相互作用，pertactin从常规的硅基色谱柱中洗脱时呈现出分裂峰。然而，在不改变流动相、流速或进样量的情况下，pertactin从XBridge色谱柱中洗脱时出现一个明确定义的单体峰（图2下）。两种情况下，MALS均提供了摩尔质量的绝对定量，另外MALS定量证实第二个峰不是由于色谱柱上二聚体解离或其他共同洗脱样品而产生的。

图2. XBridge Premier色谱柱促进理想的色谱分离.Pertactin在常规的硅基SEC柱(上)和Waters XBridge Premier Protein SEC柱(下)洗脱, 通过MALS确定摩尔质量并显示在光散射色谱图上.

MALS技术蛋白分析中的优势

尽管XBridge Premier 色谱柱得到了峰型良好的色谱峰和高分辨率，但是Pertactin单体（60KD）竟然比BSA单体(66KD)更先被洗脱出来。如图3所示，这种反常现象是否与蛋白构象的差异有关? DAWN 的QELS组件提供的在线DLS测试有助于我们准确做出判断。BSA单体流体力学半径Rh测定值是3.5nm, 而Pertactin单体Rh测定值是4.0nm (图3所示)。Rh与洗脱顺序的对应关系（尺寸越大，越先被洗脱）表明色谱条件合适，分子的分离是基于扩散尺寸也就是Rh的差异实现分离。值得注意的是，这两种蛋白的尺寸差异与它们的分子量无对应关系，进一步凸显了MALS测定绝对分子量的意义。

图3， BSA和pertactin 流体力学半径Rh（WyattQELS模块测定）与光散射信号叠加图。

传统柱校正方法存在一定局限性，尤其当样品与色谱柱存在二次相互作用的时候，这种局限性更加明显。如图4，SEC-MALS可以准确测定UT单抗单体，BSA单体以及BSA二聚体的分子量（图4上），但是UT抗体单体相较于BSA单体洗脱顺序异常。

在线 DLS 表明,与pertactin有所不同，UT单抗的分离不仅仅是基于流体力学半径Rh的差异。 如图4（下）所示，UT单抗单体的Rh(5.6nm)要比的Rh（4.4nm）高的多，但是UT单抗单体却晚于BSA二聚体洗脱，可能的原因是UT单抗与色谱柱存在二级相互作用。优化色谱条件，减少二次相互作用对于很多样品来说，需要耗费大量时间和精力。MALS不依赖洗脱时间，可直接测定分子量，同时在线DLS确认洗脱顺序是否理想。因此SEC-MALS大大降低了色谱条件优化的难度，从而节约了时间和成本。

图4. 无论洗脱次序如何，MALS都可以准确测定分子量。上图是MALS测定的分子量与光散射信号的色谱叠加图。下图是在线DLS测定的流体力学半径Rh与光散射信号的色谱叠加图。

SEC-MALS评估生物药相似性

证明仿制药与创新药物具有生物相似性是抗体类药物仿制药进入市场的一个壁垒。生物相似性研究涉及大量的体内试验，推高了仿制药物的研发成本和价格，使得一些患者无力承担他们所需的救命药。更好的体外生物相似性试验可以减轻体内试验的一些压力，从而减少将生物类似抗体推向市场所需的时间、成本和资源。

在这项研究中，通过SEC- MALS进行了比较创新曲妥珠单抗抗体药物Herceptin及其仿制药Kanjinti。如图5(左)所示，Herceptin和Kanjinti的单体和二聚体的摩尔质量是相同的，分别为~160 kDa和~300 kDa。此外，两种产品均含有98%的单体和~1%的二聚体。如图5(右)所示，XBridge Premier色谱柱可以将样品中的单体和低分子量(LMW)组分分离开。

两种药物均含~1% 低分子量组分;然而两种药物的低分子量组分的摩尔质量不同，Kanjinti 的为47 kDa, Herceptin 的为60 kDa。有趣的是，光散射数据也揭示了两种药物的高分子量(HMW)组分的差异。由于光散射强度与浓度和摩尔质量成正比，因此MALS特别适合于检测和定量蛋白质聚集体，对于低浓度的蛋白质聚集体在仅使用UV或RI作为检测器时可能无法被检测到。在这个案例中，Herceptin中含有一个特别的高分子量组分，这种高分子量组分在Kanjinti中不存在，这个高分子量组分的Rh为11 nm, Mw为1.4 MDa，仅占占总质量的0.1%，但可以通过MALS清晰识别。

图5：MALS能够对单克隆抗体的体外生物物理相似性进行详细的比较。左图为由MALS测定的LS色谱图和分子量叠加图。右图为LS色谱图的局部放大图。

使用GTx gene therapy色谱柱和SEC-MALS加强对AAV多属性定量分析（MAQTM）

AAV病毒是一种单链DNA病毒，已经成为一种常用的基因治疗递送载体。由MALS定量的AAV关键质量指标包括病毒滴度，实心率和聚体含量。SEC-MALS提供了一种稳健和易于操作的方法，这种方法可以在30min内检测上述关键质量指标和附带的表征结果。

图6显示了用SEC-UV-MALS-RI分析的2批次AAV样品。通过结合光散射，dRI和280nm以及260nm的数据，可以测定洗脱峰所对应的蛋白衣壳及DNA的摩尔质量，并量化色谱图中每个点的衣壳滴度和有效载荷。实心和空心AAVs都能从XBridge Premier GTx column很好地洗脱下来，并从二聚和更高的聚体中分离出来。如图6所示，SEC-MALS法检测了单体峰对应的衣壳和核酸摩尔质量。除了可以定量衣壳和DNA的摩尔质量外，ASTRA软件的Viral Vector分析方法可同时定量AAV物理滴度（Cp）和实心率（Vg/Cp），具体总结见表1。虽然两个实心AAV样品有相似的衣壳含量(Vg/Cp ~ 1)，但实心批1的浓度只有批2的一半。

图6.两个实心AAV样品的多属性定量分析结果与光散射色谱图。上图，具有摩尔质量的LS色谱图。下图为具有颗粒浓度与LS色谱图

XBridge Premier GTx 色谱柱也能提供比传统硅基填料色谱柱更灵敏的SEC-MALS结果。如图7所示，洗脱下来的病毒滴度的测量值非常接近进样的病毒滴度，甚至低于当前的LOQ,即5 x 1010particles/ml(见ASTRA AAV SOP，该数值是由传统的7.8×300mm硅基色谱柱测定)。灵敏度的提升有助于节省宝贵的样品或增加信噪比，同时增加了方法的稳健性。

表1，通过组合SEC-UV-MALS测得的多种关键质量参数，AAV8样品由贝勒药学院提供。

图7，用7.8 x 300 mm XBridge premier GTx色谱柱测得的定量限低于传统的同尺寸硅基色谱柱测得的定量限。

量化较大尺寸的AAV聚集物

如图8所示，硅胶材质的4.6mm SEC色谱柱只能部分分离AAV聚合物和单体。相比之下，7.8mm GTx SEC色谱柱可将聚合物完全分离出主单体峰，甚至提供了不同聚合物亚种的分辨率。这种聚合物分辨率的提高有助于更好地识别和定量分析聚合物和颗粒污染，因此在AAV质量控制中非常有用。

然而，SEC可能会破坏或以其他方式过滤高聚物。对聚合物种类进行更加准确的定量分析需采用FFF-MALS（场流分级与多角度激光散射、dRI和UV联用）。由于没有固定相，FFF可替代尺寸排阻分离法，不会剪切或过滤掉高聚物。

此外，已经发现通过UV或荧光对高聚物进行定量分析往往会大大高估它们的丰度，但MALS信号可提供更准确的定量分析。

图8.聚合物的放大色谱图。比较中使用的是贝勒医学院提供的AAV8血清型第1批次的实心AAV样品。WTC AAV色谱柱是4.6mmx300mm的硅基柱。XBridge Premier GTx是7.8mmx300mm的色谱柱.

Conclusions

Xbridege Premier SEC 色谱柱的增强色谱能力能提供更优异的分离能力和高水准的光散射数据。对于蛋白样品，Xbridge Premier色谱柱能够提供优异的分离度并能最大程度地降低蛋白样品和色谱柱间的相互作用力。几乎不需要方法优化，该类型色谱柱就能作为从治疗类抗体到疫苗抗原的多种待测物的平台色谱柱。利用MALS和高分辨率质谱还能实现体外生物类似物的分析，工业界能快速鉴定有用的趋势和关键因素，进而节省后续的体内试验的时间和资源。

对于AAV方面的应用，XBridge Premier GTx色谱柱能保证灵敏度高,高回收率和完美的光散射数据质量，有助于成功地实现AAV样品的多质量属性分析。在以前，这些关键质量属性需要多种复杂的仪器，例如ELISA用来检测物理滴度，qPCR用来检测基因滴度，或AUC用来检测空实率。但SEC-MALS一次进样就可以同时测量这些关键质量属性。

总之，由于XBridge Premier Protein SEC色谱柱和XBridge Premier GTx色谱柱对色谱效能的增强，完善了Wyatt MALS表征治疗蛋白和AAV样品的方案，高性能SEC色谱柱意味着MALS能够提供的更精细和稳健的多质量属性定量。

Acknowledgments

感谢德克萨斯大学奥斯汀分校提供的pertactin和UT抗体样品，感谢贝勒医学院提供的实心和空心AAV样品。

References

1.   Liu, J., Eris, T., Li, C., Cao, S . & Kuhns, S . Assessing Analytical Similarity of Proposed Amgen Biosimilar ABP 501 to           Adalimumab. BioDrugs 30, 321–338 (2016).

2.  Troxell, B. et al. Application of Size Exclusion Chromatog- raphy with Multiangle Light Scattering in the Analytical Development of a Preclinical Stage Gene Therapy           Program . Hum Gene Ther 34, 325–338 (2023).

3.   Fu, Y. et al. Comprehensive biophysical characterization of   AAV-AAVR interaction uncovers serotype- and pH-depend- ent interaction. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 234, 115562 (2023).

4.   Bartalis, J et al.AN 2004:  Why  and  how  to  quantify  AAV  ag - gregates  by  FFF - MALS .

5.   Bian, J., Gobalasingham, N ., Purchel, A. & Lin, J. The Power of Field- Flow Fractionation in Characterization of Nano-   particles in Drug Delivery. Molecules 28, 4169 (2023) .

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