高效药物清洁验证的通用 UHPLC/UV/MS 方法

摘要

清洁验证 (CV) 是药品生产质量管理规范 (GMP) 对原料药和药品生产的要求。大多数药物的清洁验证研究通常选用配备紫外检测器的液相色谱仪，其灵敏度水平约为 20-50 ng/mL。对于高效药物，应用配备扩展光程流通池的紫外检测或质谱检测可实现灵敏度水平低至 ng/mL 的清洁验证方法。在 Agilent 6150 系列单四极杆液质联用系统上使用安捷伦喷射流离子源的UHPLC/MS 方法具有更高的灵敏度，其显示出更低（约 0.5 ng/mL）的定量限 (LOQ)。此外，采用更高的进样量可进一步降低 LOQ。本研究介绍了对浓度范围为 0.5 ng/mL 至 1000 ng/mL 的五种模型药物的 2 分钟通用清洁验证方法。该通用清洁验证检测方法通常可适用于许多不同的药物，只需极少的方法开发、认证和转换工作。本应用简报还介绍了采用用户补充的 NIST 质谱库搜索程序鉴定未知化合物。

前言

必须进行清洁验证 (CV) 以证明生产链（容器和加工设备）的清洁度，确认活性药物成分 (API) 已被充分去除，达到预先确定的可接受限值。开发针对高效药物（SafeBridge 类别 3B 或 4）或具有弱发色团的药物的高灵敏度 CV 方法极具挑战性。对于高效药物而言，可接受标准通常要求检测限低至 ng/mL 级。利用长光程 UV 流通池或质谱检测器能够提高传统 LC-UV 方法的灵敏度。此外，偶尔观察到未知化合物，应当在 CV 研究中进行鉴定。本研究的目的是展示一种快速、灵敏、通用的 UHPLC/UV/MS 方法，用于对高效药物进行清洁验证，并建立一种更简单的鉴定未知化合物的方法。

配备 UV 最大光强流通池的 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统由于光程扩展而表现出更高的信号强度。在早期研究中，使用传统 HPLC 色谱柱所进行的清洁验证研究表明，60 mm 最大光强流通池的灵敏度相比于标准 10 mm 流通池提高了约 2-5 倍。在此研究中我们证实了采用更快速的 UHPLC 方法获得了相似的结果。

Agilent 6150 系列单四极杆质谱仪也同样适用于高灵敏度 CV 检测。安捷伦喷射流离子源 (AJS) 通过使用热鞘气将喷雾集中防止离子源中的进一步柱外电喷雾谱带展宽，与标准电喷雾离子源 (ESI) 相比，灵敏度提高多达 10 倍。AJS 离子源还适用于更宽的流速范围 (20–2000 μL/min)。CV 方法所用的高流速可缩短分析时间，且不影响峰容量。AJS 离子源相比于常规 ESI 源，还能够使不同类别的化合物实现更有效的离子化。单一通用的 UHPLC/UV/MS CV 方法提高了中试规模或制造工厂的实验室工作效率，对快速样品周转提出了更高的要求。

在 CV 样品中，可能存在不同的残留化合物，例如来自当前或之前批次的 API、副产物、降解物、赋形剂或清洁剂。借助用户创建的质谱库，LC/UV/MS 检测还可鉴定色谱图中的未知峰。Agilent OpenLab ChemStation 有利于在 NIST 质谱库搜索程序中创建附加的自定义谱库。本应用简报记录了使用 Agilent Poroshell C18 色谱柱 (3.0 × 30 mm, 2.7 μm) 针对五种常见药物开发的通用高通量 UHPLC/UV/MS 方法。相比于那些全多孔颗粒填料色谱柱，这种以表面多孔颗粒填料填充的快速液相色谱柱可改善动力学性能，并且能够在 1 mL/min 流速下运行 2 分钟。使用该程序，采用 UV 和 MS 相结合的方法能够对浓度范围为 0.5 ng/mL 至 1000 ng/mL 的五种模型药物的混合物进行测量。对此方法的方法性能（例如特异性、精密度、准确度、检测限 (LOD)、定量限 (LOQ) 和线性）进行测定，结果发现其能够满足预期用途要求。还展示了自定义质谱库的创建及其搜索功能。该方法可能适用于各种药物的 CV，且所需的方法开发、认证和转换工作极少。

结论

高效药物的 CV 需要采用高灵敏度和高通量方法。本研究开发出了一种用于 CV 的 2 分钟通用方法，并采用五种常见药物对其进行了验证，结果展示了该方法在此应用中的性能。使用 UV 和 MS (SIM) 检测分别可获得 20-50 ng/mL 和 0.5 ng/mL 的 LOQ。使用最大光强 UV 流通池和大体积进样可进一步改善该方法，其灵敏度可分别提高 2-4 倍和 2 倍（使用 10 μL 的进样量）。Agilent 1290 Infinity UHPLC 与配备安捷伦喷射流离子源 (AJS) 的 Agilent 6150 单四极杆质谱仪在 SIM 或 SCAN 模式下运行，为 CV 研究提供了一种通用的工具，适用于对来自生产设备的冲洗溶液进行定量分析。此外，通过搜索用户补充的质谱库可轻松鉴定未知化合物。