人免疫球蛋白 G 的高灵敏度和高重现性糖基化分析——使用配备 Agilent AdvanceBio 2.7 μm 糖谱分析色谱柱和荧光检测器的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统

摘要

本应用简报证实，使用配备新型 HILIC 色谱柱和荧光检测器的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱仪，可对人免疫球蛋白 G 的 N-连接糖链进行灵敏、重现的分析。对人 IgG N-连接糖链文库分析的保留时间和峰面积精度进行测定。此外，对于具有低检测限和低定量限的五种糖链标准品（M5、A2G2、A2G2S1、FA2G2S1 和 A2G2S2）混合物，在 0.016-1 pmol 的范围内具有良好的线性。

配备 Agilent AdvanceBio 2.7 μm 糖谱分析色谱柱和荧光检测器的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱仪是一款出色的系统，可实现灵敏且重现的 2-AB 衍生人免疫球蛋白 G 释放 N-连接糖链分析。

前言

抗体代表一大类重组的治疗性蛋白质，是一种主要的药物类别。此类治疗性药物的疗效高度依赖于正确的糖基化模式。目前，获批的所有治疗性单克隆抗体 (mAb) 均为免疫球蛋白 G (IgG)。对其糖基化模式的分析是 QA/QC 流程中一个重要的环节。此外，来自血浆的人 IgG 的糖基化模式可以反映患者的健康或疾病状态。人 IgG 中有一个单独的保守 N-连接糖基化位点，位于每条重链 Fc 段的 Asn-297 处。因此每个 IgG 可连接具有高异质性的两个糖基，并可产生含至少 30 种糖型的混合物。来自血浆的人IgG N-连接糖链主要为二分支复合型结构，主要由零至两个半乳糖残基以及一至两个唾液酸进行核心岩藻糖基化。此外，人 IgG 携带少量的二分支 N-乙酰氨基葡萄糖 (GlcNAc) 残基。一般来说，重组产生的 mAb 具有稍简单的模式，不具有非岩藻糖基化或二分支 GlcNAc 糖链结构。

这种 mAb 中还发现了甘露糖-5 等其他更不成熟的高甘露糖结构，大多数量较少。

由于复杂生物样品的糖基化分析得到的丰度通常很低，因此蛋白质糖基化模式的分析极具挑战性。使用亲水相互作用液相色谱 (HILIC) 联用带荧光检测器的 HPLC 分离 AB 标记的糖链结构，是一种可靠且灵敏的糖基化分析方法。本应用简报使用这种方法来测定精度、线性和灵敏度。

本文特别展示了使用配备 Agilent AdvanceBio 2.7 μm 糖谱分析色谱柱和荧光检测器的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱仪，可对人免疫球蛋白 G 的 N-连接糖链进行灵敏且重现的 HPLC 分析。

本文依照美国功能性糖组学协会 (CFG) 的规定，使用糖链符号式结构归属糖链（图 1）。归属的糖链采用 Oxford 糖链命名法和生物制药 mAb 风格。

结论

本应用简报展示了配备 Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱和荧光检测器的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元泵液相色谱系统是一款出色的系统，适用于对 AB 标记的人 IgG N-连接糖链实现灵敏且重现的 HPLC 分析。

人 IgG N-连接糖链文库的分析对所有主要的多糖结构均显示出良好的分辨率。结果发现保留时间精度低于 0.27%，峰面积精度低于 3.5%。保留时间和峰面积的所有 RSD 测量值均处于通常报告的范围内10。对于以 Campbell 等人12 提到的结构归属软件而言，高精度的保留时间对正确归属聚糖结构非常重要。

将 0.016-1 pmol 的五种糖链标准品（ M5、A2G2、A2G2S1、FA2G2S1 和 A2G2S2）混合物依次以 1:2 进行稀释，以进行线性测定。所有相关性曲线均表现出优异的线性，除 A2G2S1

的 0.997 外，相关系数均超过 0.999。LOD 范围为 9-12 fmol，LOQ 范围为 30-40 fmol。

针对本研究的系统对荧光波长优化后，使用 1260 Infinity 系列荧光检测器获得了更高强度以及更出色的信噪比。系统采用了更低的 260 nm 激发波长，而非 330 nm（Anumula 200511 推荐值）。
配备糖谱分析色谱柱和荧光检测器的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱仪是一款出色的系统，可实现灵敏且重现的 2-AB 衍生 N-连接糖链的 HPLC 分析。