使用 UHPLC/MS/MS 对杏仁、榛子、 花生和开心果中的 191 种真菌毒素及其他真菌代谢物进行筛查和定量分析

    摘要

    本应用简报介绍了用于测定杏仁、榛子、花生和开心果中的191 种真菌毒素及其他真菌代谢物和验证测定结果的多目标方法的开发。除受欧盟监管的所有真菌毒素以外，该方法还涉及到常在食品中发现的许多真菌毒素。该方法包括酸化的乙腈-水混合液的简单萃取、原萃取液的稀释以及UHPLC/MS/MS 的测定。采用溶剂标准品对所有化合物进行校准。

    此外，本应用简报还介绍了对四种测试基质中65 种最重要的真菌毒素进行的部分验证工作。该方法表现出优异的灵敏度，能够检出花生中低至0.04 μg/kg 的恩镰孢菌素B3，并具有良好的重现性，大多数分析物的标准偏差均小于10%。大约60% 的基质-分析物组合获得了70% - 120% 的表观回收率。回收率较低的原因包括萃取回收率较低（例如伏马菌素类）或几种较早流出的分析物所存在的信号抑制。少数情况下存在信号增强效应，因此导致表观回收率较高。

    该方法适用于受天然污染的坚果样品分析，总共能够鉴定出40 种不同的真菌代谢物。有趣的是，最常检出的毒素并非当前受欧盟监管的化合物，而是白僵菌素、恩镰孢菌素B和巨孢子素。污染最严重的榛子样品中包含26 种不同的毒素。全部结果在Varga 等人的文章中有更详细的介绍[1]。

前言

    真菌毒素是真菌的次生代谢产物，可对人和动物产生急性或慢性毒性作用。由于耕种和储存过程中可能发生真菌的集落，因此谷物、坚果、水果、香料和咖啡等各种饲料和食品中均可找到真菌毒素[2]。真菌毒素归入不同的化学类别，会表现出差异极大的理化特性。在目前已鉴定出的几百种真菌毒素中，大约十二种被认为具有严重的健康危害，故在食品和饲料中受到监管。欧盟委员会法规(EC) 1881/2006 及其修正案中规定了食品中黄曲霉毒素、呕吐毒素、伏马菌素、赭曲霉毒素A、展青霉素和玉米烯酮的最高含量[3]。此外，欧盟委员会2013/165/EU 建议中还规定了指示性含量，我们应该据此对呈现T-2 和HT-2 毒素的因素进行调查[4]。这些化合物包含在常规监测项目中（如根据国家食品安全局等部门的规定），且有这些真菌毒素在不同商品食物中存在的数据。对共存真菌毒素进行同时定量分析时，单一目标方法一直以来都被基于LC/MS 的多目标分析方法所取代。现代三重四极杆仪器的性能改进以及软件工具的开发（例如安捷伦动态MRM 功能，该功能有助于分析人员更轻松地开发并完善大量目标化合物的快速分析方法）促进了这一趋势的发展。

    多目标分析方法的挑战在于需要从各种食品中高效萃取出理化特性大不相同且天然存在的毒素浓度差异极大的分析物。已开发出的多数多目标分析方法针对的是未加工谷物中真菌毒素的筛查[5]，而缺少关于坚果等其他基质中真菌毒素污染的全面信息[1]。

    坚果是由硬壳和种子组成的干果。按植物学的理念，真正的坚果是指果皮不开裂的种子。以食品的背景，使用的“坚果”这一术语并没有那么严格，甚至其中包括的杏仁在植物学上属于核果，而花生实际上属于豆类。为简单起见，本应用简报中研究的所有四种基质（杏仁、榛子、花生和开心果）均称为坚果。尽管田间的农产品最常受到镰刀菌属、链格孢属与枝孢属真菌的感染，但曲霉属、青霉属和木霉属真菌却是储存过程中腐败的主导因素[6]。现有的大部分数据是来自坚果中产生的黄曲霉毒素和赭曲霉毒素A；而关于其他真菌毒素污染的信息则非常有限。

    本应用简报介绍了用于坚果中191 种真菌毒素和真菌代谢物定量分析的UHPLC/MS/MS 多目标方法。该方法为采用酸化的乙腈-水混合液进行单次萃取，然后稀释原萃取液以进行后续测定。本文就杏仁、榛子、花生和开心果中65 种最重要污染物的方法性能参数进行了示范性的展示。该方法采用了从奥地利和土耳其市场上购买的多种坚果。在Varga 等人的文章中[1] 对这种方法及其获得的结果进行了更为详细的介绍。

    结论

    本文开发出了一种用于测定191 种真菌毒素及其他真菌代谢物（包括欧盟监管的所有真菌毒素）的基于UHPLC/MS/MS 的多目标方法。该方法充分利用Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统的低延迟体积及其能够在UHPLC 分离中控制高反压的优势提高了色谱分离度，从而使分析物与基质实现了更彻底的分离。该方法包括快速、简便而经济的溶剂萃取程序以及进一步将稀释的原萃取液进样至UHPLC/MS/MS 系统进行分析的步骤。该方法得益于Agilent 6460 三重四极杆质谱仪的高灵敏度和高稳定性以及安捷伦喷射流离子源的通用电离功能。采用动态MRM 的采集法能最大限度延长每种化合物的驻留时间，并通过优化离子源参数以在一系列目标化合物之间实现良好平衡。

    对杏仁、榛子、花生和开心果中所有受监管且最常被检出的65 种真菌毒素的方法进行了验证，结果表明该方法能够对这65 种真菌毒素进行定量分析。对于其他分析物而言，该方法仍可提供半定量信息。尽管在坚果上对该方法进行了验证，但该方法也可用于筛查多种其他食品和饲料基质中的真菌毒素。本应用简报所介绍的方法是对单一分析物或组分析物检测方法的适当补充，能够有助于对各种商品食物中真菌毒素的存在状况加以了解。

    该方法已应用于分析53 种不同的坚果样品，期间已检出了40 种不同的真菌毒素和真菌代谢物。除黄曲霉毒素（当前受欧盟监管的唯一一种坚果中的真菌毒素）以外，其他毒素均为坚果中的相关污染物。在50% 以上的样品中检测到了白僵菌素、恩镰孢菌素B、巨孢子素、3-硝基丙酸、大黄素和交链孢霉甲基醚，部分化合物的浓度极高。方法首次认了榛子中HT-2 和T-2 毒素的存在。检出的许多真菌毒素尚未经过充分的毒理学评估，此外，关于共存毒素的加合效应甚至协同效应的信息仍然缺失。