共探前沿｜赛默飞大豆多肽液相解决方案

共探前沿｜赛默飞大豆多肽液相解决方案

飞飞 赛默飞色谱与质谱中国

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郑喆  李丹(长春大学)

1、引言

大豆多肽属于生物活性肽，是以大豆蛋白为主要原料，经过提取分离、纯化并精制而成的低聚肽的混合物(蛋白质水解物)，通常以由 3～6个氨基酸组成的小分子肽为主，还含有少量游离氨基酸、糖类、水分和无机盐等。大豆多肽具有较高的营养价值，其氨基酸组成与大豆蛋白完全一样，是一种理想的新型大豆深加工产品【1】。

大豆蛋白经酶水解后，其产物中含有多种生理活性肽小分子大豆肽不仅溶解性好、黏度低，而且在人体内消化吸收快。另外，还具有降血压、降血脂、降胆固醇、促进矿物质吸收、脂肪代谢、免疫调节、抗氧化、抗癌、抗辐射、减肥、调节血糖浓度、抗疲劳、低过敏性、促进微生物的生长发育和代谢等多种不同的生物活性【2】。

大豆蛋白酶水解产物在食品工业中一般应用于饮料、奶粉奶酪乳制品和代乳品中，也可添加在肉类食品和醋、酱油等发酵食品中，可以用来生产面条、馒头、面包以及冷冻食品. 以显著提高产品的品质和营养价值，并增强产品的口感风味【1】【2】。

《GB/T 22492-2008 大豆肽粉》为生产企业提供一个通用的产品质量规范，但对于大豆肽粉在大豆蛋白提取、酶解、发酵、肽的过膜分离（超滤、微滤、纳滤）、色谱分离（液相、GPC）、脱色、脱苦等工艺控制环节没有指导方法。

本文探索了豆粕蛋白酶解粗肽的反相液相色谱分析方法，操作简便，通用性好，适用于质控环节，为液相色谱质谱联用测序提供了先导方法。

2、样品前处理

2.1试剂配制

流动相：取3mL色谱级甲酸加入1L色谱级乙腈中，无需抽滤，混匀超声10min；取3mL色谱级甲酸加入1L超纯水中，无需抽滤，混匀超声10min。

2.2试剂配制

样品配制：样品为豆粕蛋白的酶解产物，未经过膜处理，多肽分子量分布很广的粗品。分别称取大豆肽1号2号3号试样各20mg于三个2ml液相小瓶中，各加超纯水1ml，涡旋1min，用0.22um尼龙66滤头过滤，待用。

3、色谱条件

3.1仪器信息

仪器硬件：ThermoFisher Vanquish液相色谱仪

色谱软件：变色龙Chromeleon 7.3.1；中药指纹图谱相似度评价软件

3.2方法信息

色谱柱：Accucore Vanquish C18 2.1 mm×150 mm，1.5 μm（PN：27101-152130）

流动相：A：0.3%甲酸水溶液；B：0.3%甲酸乙腈溶液，

流速：0.2 mL/min，梯度程序见表1：

表1. 梯度洗脱程序

进样量：2 µL

柱温：30℃（still air模式）

检测器波长：280nm

4、样品分析谱图及测定结果

4.1典型色谱图

图1a. 大豆肽1号样品和空白色谱图叠图

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图1b. 大豆肽1号224nm、280nm色谱图及光谱信息

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4.2重复性

图2. 大豆肽3号样品六针连续进样色谱、压力叠图

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表2. 大豆肽3号样品六针连续进样保留时间和峰面积稳定性数据

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4.3相似度评价

借助中药指纹图谱相似度评价软件，可以比较两个谱图之间的差异，进而了解来料大豆肽的批次间差异，为指导工艺调整提供科学直观依据。

图3. 大豆肽1号、2号、3号指纹图谱和相似度评价结果

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● 积分参数平滑为0.4，即加大平滑令色谱峰以峰组形式存在，数目相对减少时，以大豆肽3号为对照时，大豆肽1号的相似度为0.663，大豆肽2号的相似度为0.7。

● 针对复杂样品，以峰组形式积分（结合平滑等参数），可以得到数目合适，又能覆盖主要色谱峰的积分谱图。基于此的评价结果才更为合理。

结果与讨论

1、客户样品为豆粕蛋白酶解产物，未经过膜分离，多肽分子量分布跨度大，同时不排除混有糖、蛋白、氨基酸等其他化合物。若能将样品通过超滤膜分离净化，按照分子量范围分成几组肽段，分别建立液相方法，则借助液相做质控更科学严谨一些。

2、样品前处理少，优势在于快捷高效，成本低，适于工厂化验室操作，对人员要求不高。劣势在于样品基质复杂、粗肽组份繁杂，对液相的稳定性要求非常高。峰组ABCD的保留时间稳定性在1%以内、峰面积重现性在2%以内。每组六针进样压力曲线都非常平稳波动仅在0.4 bar，该方法稳定性非常好。

3、创造性的首次将粗肽分析与中药指纹图谱相似度评价软件相结合，可以从整体分析、在宏观上了解粗肽批次间的差异；凭借Vanquish液相卓越的稳定性，在变色龙软件里平行比较两批次样品谱图的细节差异。进而从宏观和微观两方面入手，在调控酶解、过膜超滤、GPC分离等工艺环节中发挥指导作用。解决粗肽可视化直观化的质控问题。

4、做相似度评价时，建议选取成熟稳定粗肽样品中主要成分色谱峰或峰组作为评价标的。积分时通过加大平滑将色谱峰以峰组的形式积分，即简化谱图，又可提升谱图间可比性。通常相似度0.9以上认为批次间是稳定一致的。解决粗肽质控评价标准的建立问题。

5、从向食品中添加大豆肽，以提升食品（代乳制品、酱油、面食等）营养和品质角度来说，本法做来料质控基本可行。从向食品中添加活性肽，打造功能性保健食品角度来说，还需进一步对来料做超滤膜分离，得到5000Da以下的肽，本法为MS友好流动相可以直接结合高分辨质谱找到有价值的活性肽。从科研角度来说，本法基础上扩展CAD电雾式检测器，可以检测无紫外吸收和弱紫外吸收的物质，如氨基酸、GABA（伽马氨基丁酸）、单糖多糖等。

6、客户要求用Accucore 1.5 μm的色谱柱开发该方法，以期面对极其复杂样品时，能得到较好分离度，考虑到样品和基质实际情况，推荐客户试用Hypersil GOLD Peptide 1.9um，175Å色谱柱两根串联使用提高复杂样品分离能力，赛默飞还有其他适合分析多肽的色谱柱，如Accucore 150 C4，Acclaim 300 C18，BioBasic 300Å等。

7、该方法操作简单仅需过滤样品即可，是降本又增效的液相色谱分析方案，将会对食品工业中添加粗肽、大豆肽的企业提高品控水平。

8、本文为探索性质的实验。为解决粗肽、大豆肽生产过程中部分质控问题，提出跨界解决问题的思路，若能结合GPC做分子量分布研究，将其整合为一套完整方案，则产品质控会更加全面严谨，终将有利于生成企业、消费者和监管部门。

合作伙伴

李丹课题组：李丹，男，生于1972年10月；江南大学食品科学博士、韩国国立首尔大学 (Seoul National University) 食品科学与生物技术系博士后、美国佛罗里达大学 (University of Florida) 微生物与细胞科学系访问学者；教育部新世纪优秀人才；吉林省二级教授，吉林省有突出贡献的中青年专业技术人才，吉林省拔尖创新人才二层次。现任长春大学“大豆生物加工技术吉林省发改委工程实验室”主任、“农产品加工吉林省教育厅重点实验室”主任。主要从事食品科学与农产品加工技术领域的教学与科研工作。主持完成国家自然科学基金“面上项目”2项，主持完成科技部“国际科技合作项目”1项，主持完成“教育部新世纪优秀人才支持计划”和“教育部留学回国人员科研基金”项目2项，主持完成省市厅级科技计划项目11项；在本学科国际著名SCI期刊，发表英文论文50余篇，其中在中科院学术期刊分区一区期刊发表论文18篇；获得授权发明专利6件，获得英国Elsevier最多引用论文奖、吉林省科技厅吉林省科技奖自然科学奖二等奖等省部级科研成果奖励9项。

参考文献：

【1】大豆多肽的研究进展 高蕾蕾，李迎秋2018 年第 2 期 江苏调味副食品 总第 153 期 ＊? DOI: 10. 16782 /j． cnki． 32-1235 /ts． 2018. 02. 002

【2】大豆蛋白酶水解产物对面粉糊化特性的影响崔会娟，王璐，郭兴凤 *河南工业大学学报（自然科学版） Journal of Henan University of Technology（Natural Science Edition） 第 36 卷第 1 期 2015 年 2 月

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