2020/07/08 11:51
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布鲁克与苏黎世联邦理工学院、德国马普研究所和多伦多大学合作,将PASEF与DIA(Data-Independent Acquisition,数据非依赖采集)的优势相结合,产生了一种新的采集模式称为dia-PASEF@。
在dia-PASEF@扫描模式中,母离子在进入四级杆之前已经通过淌度进行了累积和分离,根据碰撞截面积(CCS)大小依次洗脱(与m/z有一定相关性),这样四级杆就可以根据洗脱离子的m/z进行离子选择,并且每批PASEF都会有多个窗口进行扫描,从而提高离子的利用率,避免了传统DIA方法中离子利用率低的问题。此外,使用离子淌度和质量数双重隔离窗口来触发MS/MS,提高了母离子选择和匹配的准确性,并降低了二级混合谱图的复杂性。并且在一级热图中,可以选择多电荷区域作为dia-PASEF@的母离子窗口,有效屏蔽单电荷杂质的干扰。
dia-PASEF@具有更深的蛋白质组覆更高的分析通量和更优异的灵敏度,适合于高通量、微量样本的蛋白质组定量分析。采用95min梯度,单针进样200ng的HeLa,利用dia-PASEF@可以鉴定超过7,600种蛋白质、66,000种肽段。采用不同长度的梯度,30min可以鉴定6395个Hela细胞蛋白、4032个Yeast蛋白,达到快速、深度覆盖。即使在微量样本时,如单针进样10ng的Hela,仍能鉴定3000种蛋白质。布鲁克在ASMS 2020发布了高通量dia-PASEF@方案(图9A),即将Evosep One LC与timsTOF Pro再次联合,最大程度发挥Evosep One LC快速分离和timsTOF Pro扫描速度和稳定性的优势。该方案目前有4种方法(图9B),分别采用4.8min、7.2min、14.4min和24min色谱方法,对应的每天可以分析300、200、100和60蛋白质组学样本,把蛋白组学分析通量提升到一个全新的高度。分析结果(图9C,9D)显示出此方案在保证分析通量的同时,蛋白覆盖深度也有很好的保证,4.8min的分析单针可以鉴定2158蛋白,24min可以得到与传统蛋白组学长梯度分析相当的结果。
图9. 高通量dia-PASEF@方案
图10. Roman Fischer教授采用dia-PASEF@技术进行大队列研究
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