细胞荧光计

p style="TEXT-ALIGN: center"img style="WIDTH: 500px HEIGHT: 404px" title="2015812530441140.jpg" border="0" hspace="0" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201508/uepic/28a495d3-f847-4968-980e-a818f89bc0ae.jpg" width="500" height="404"//pp style="TEXT-ALIGN: center"strong活细胞中的塑料球能发出激光。图片来源：M. SCHUBERT/strong/pp　　两组研究人员分别将微小激光器放置在了活细胞内。这听上去可能有点像蚂蚁侠的下一代武器，但这个“小玩意”将极大提高生物学家追踪单个细胞活动的能力——这可能惠及从发育生物学到癌症研究的诸多领域。/pp　　“这有可能做一些你利用其他技术做不到的事。”英国敦提大学生物物理学家David McGloin说。例如，该激光器能追踪的细胞比荧光标记能追踪的更多，并且比高频ID等萌芽技术更简单易用。剑桥大学神经生物学家Kristian Franze也赞同这一观点。“如果他们能开发出适用于活细胞的此类技术，那对许多人而言将非常有趣。”他说。/pp　　要制作一个激光器，你需要两件东西：一种能被激发产生光的材料或“媒介”以及一个回荡着特定波长的光的“共振腔”，就像管风琴会同特有频率的声波共鸣一样。与谐振腔共振的光会刺激该材料发出更多光，极大地放大其效果来创造激光，结果将产生一个能放大光量的反馈回路。/pp　　之前，科学家也曾“摆弄”过以细胞为基础的激光器。例如，2011年，美国哈佛大学医学院生物医学家Seok Hyun Yun和现供职于英国圣· 安德鲁大学的物理学家Malte Gather，利用工程改造后包含绿色荧光蛋白的单个细胞作为发光媒介，并将其置于一个共振腔内，从而制造了一个激光器。但没有人制出放置在单个细胞内的激光器。/pp　　研究小组多年来一直在探索以单细胞为基础的激光，希望在活组织内造出会发荧光的细胞，以便在这些细胞工作时跟踪它们，深入揭示身体内部机制，比如癌症是如何开始的。目前，Gather和Yun正在利用类似技术分别进行研究。/pp　　一个困难环节是将腔囊放置在细胞内。Gather和同事将细胞与直径约为5~10微米的塑料球混合，这些小球被掺杂了荧光染料。小珠子充当了空腔，而染料则充当了媒介。细胞经由内吞作用将小球吸入“体内”，这一过程就像免疫细胞吞噬病原体。由于这些球体用荧光染料浸过，所以用一种颜色的光撞击后，它们会发出另一种颜色的光。这种光接着在球体内共振，引发激光作用，并放大自己。重要的是，每一束激光会根据球体的精确尺寸发出12种不同波长的光。相关论文发表在近日出版的《纳米快报》上。这一技术能作用于4类细胞，包括人类巨噬细胞和一种白血细胞。/pp　　研究人员指出，这一技术在细胞传感、医疗成像等领域有着广泛应用。“改写传统激光研究领域的知识并在这个平台上展开研究以便将激光性能最优化，将是一件有趣或者说非常激动人心的事情。”Yun表示。/pp　　之后，研究人员设计出一种5纳秒的光脉冲激活这些染料。它发射的光能沿球体的中间线运行——通过一种名为全内反射的过程进行约束。特定波长的共振和增加会更强烈，直到珠子发出足够的激光。/pp　　Yun和同事Matjaz Humar还设法诱导细胞“吞下”塑料珠子，并且他们制造了两类共振球，相关成果日前在线发表于《自然—光子学》期刊。研究人员利用一个细胞内的脂肪滴或油滴反射和放大光，从而产生激光。Yun和Humar报告说，他们能改变波长，并且利用不同直径的荧光聚苯乙烯微球而不是被注射进去的油滴或脂肪滴标记单个细胞。理论上，利用不同组合的微球和具有不同光谱特性的染料，应当可以使为人体中存在的几乎所有细胞进行单独标记成为可能。/pp　　Yun和Gather表示，这些激光器最显著的应用可能将是追踪单个细胞的行动。每个塑料珠子的直径和光学特性都略有不同，因此它们能有效区分波长，充当细胞条形码。Gather和同事用19小时在细胞培养皿中追踪了少量巨噬细胞，而Yun和Humar也进行了类似验证。/pp　　由于激光器能在明确的波长上照亮细胞，这让它们比荧光蛋白质标记等其他细胞追踪技术更有优势。包含荧光染料和蛋白的传统荧光探针拥有相对较宽的发射光谱——约30～100纳米。这限制了能被同时使用的探针数量，因为通常很难从组织中天然分子广泛的背景发射中区分出这些发光源。但这种激光器的光谱特性使其能同时追踪数千个微小指向标。研究人员通过为每个细胞装载数个小球将这一数字扩展到数百万或数十亿。然后，每个细胞将以不同的波长组合发射激光。/pp　　但这一技术还有很长的路要走。首先，研究人员需要确定不同的细胞类型都能“吞下”小球，尤其是活组织中的细胞。Gather预测，这将不是问题。“我相信该技术是可归纳的。”他说。另外，研发人员必须缩小塑料球的尺寸。Yun承认，现在的小球会将细胞填满。但Yun和Gather已经证实，他们可以用更小的玻璃球代替塑料球。/pp　　由于细胞发光可以持续一个较长的周期，可以在较长时间里识别和跟踪活组织内的细胞，有望为研究人员提供一种很有潜力的手段，执行细胞内传感、自适应成像，还可能真正看到肿瘤细胞的生长过程。但科学家指出，目前这一技术还只用在实验室培养的活细胞中，但他们希望进一步研究能带来用于动物实验的细胞跟踪系统，并最终用于人类。“不管怎样，它非常酷!”McGloin说。/p

p style="text-indent: 2em text-align: justify "走进山东师范大学化学化工与材料科学学院实验室，在激光显微镜下，“荧光探针”使细胞呈现出色彩斑斓的效果，形态各异的图案仿佛将人带入鲜花与极光交融的海洋。然而，你能想象这不起眼的“荧光探针”通过成像监测，便能实现尽早地发现和预防重大疾病吗？/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "山东师范大学化学化工与材料科学学院唐波、董育斌、李平、王鹏、李娜等领衔的科研团队，经过近二十年的刻苦攻关，有效地解决了细胞成像这一难题，极大地推动了该领域的国际研究步伐，他们完成的“细胞稳态调控活性分子的荧光成像研究”项目于近日获得2018年度国家自然科学二等奖，成为首个以第一完成单位获得国家自然科学奖的山东省省属高校。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "早在2000年前后，当时国内的生命科学和光学成像等研究领域刚刚兴起，团队领头人唐波教授便敏锐地意识到分析化学和生命科学的紧密结合，必将推动一个新型交叉研究领域的兴起。从此，一个以化学、生物学、医学等多学科为支撑，以揭示重大疾病的发现和治疗为使命的团队应运而生。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "2013年初，以山东师范大学为项目牵头单位、唐波为首席科学家的国家重大科学研究计划（973）项目“重大疾病相关的若干重要难检活性小分子细胞内纳米传感研究”正式启动。“一定要把目光瞄准国际科研领域的最前沿，只有站位高、视野宽、反应快，才能把握住科研领域的时代脉搏，产出高质量的研究成果。”唐波不仅自己以此为标杆，还将这一理念植入了全体科研团队的“基因”之中。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "自然科学奖评审的核心指标就是原创性，而这正是“细胞稳态调控活性分子的荧光成像研究”项目的“撒手锏”。该项目在国际上率先构建成多种新型发光材料，解决了材料量子产率低与波长不可调的关键问题，为研制具有高灵敏度与光谱空间可分辨探针的筛选、设计、构建奠定了重要的理论基础。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "“在原有的检测方法中，荧光信号灵敏度差、转换效率较低，会直接影响成像质量，从而会导致医生对病人的病情错判。我们的成果创新性地运用特异性识别活性分子的机理与能量转移、电子转移等光信号转换机制，成功实现了对糖蛋白、葡萄糖、microRNA等活性分子的高选择性识别，检测速度和准确性都得到了极大提高。”长江学者董育斌教授说。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "“在疾病发生之前，我们可以通过细胞内特定指标的变化来作出预警，从而尽早地预防和治疗。而这种指标变化，需要找到特殊的化合物即‘探针’，注入活体细胞后，用高能荧光显微镜来检测‘探针’光学信号的改变来确定。”为团队作出重要贡献的徐克花教授介绍说，他们的工作就是寻找化合物、研发新材料“探针”，实现高准确度和超高灵敏检测的突破。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "“这与现阶段医学临床上采用的肿瘤检测方式不同。传统的血液检测，可能因样本离开人体而导致准确性下降，假阳性比例很高，比如前列腺癌的假阳性比例最高达60%。而使用CT检查，当发现病灶时，病情一般已进入中晚期。”青年长江学者李娜教授说，“因此，使用荧光成像方法，通过新材料‘探针’在活细胞里面检测活性物质，且是在体外保真环境进行，无创伤，无伤害。”/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "目前，团队师生所在的化学学科近十年来稳居ESI全球前1%，团队成员均有稳定的国家级课题作为依托，堪称精兵强将。“我们研究团队，不仅有化学专家，还引进了生物、医学、物理等方面的人才。大家学术背景非常多元，团队在开拓新的研究领域和方向时也非常方便。”泰山学者青年专家高雯说。/p

活体光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光（bioluminescence）技术与荧光（fluorescence）技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，今天，生物发光标记物可以标记到任何一种基因上，使对基因功能的全面细致研究成为现实。而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记，利用荧光蛋白在外源光源或是内源发光照射下被激发产生的荧光作为检测信号。研究人员能够利用一套非常灵敏的光学检测仪器直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。 该技术可被广泛应用于标记细胞或基因的示踪及检测；基因治疗在活体动物体内直接的观察和检测；基因组、蛋白组学、药学及生物技术在活体动物内的研究；药物及化学合成药物的药物代谢及毒理学监测；食品菌落生长成像；皮肤医学中皮肤疾病的体内成像；法医鉴定；微孔板成像，例如：免疫分析、报告基因、基因探针和嗜菌作用分析等；荧光团的体内成像，例如：Alzheimer疾病研究中结合嗪的β-淀粉沉淀物分析；转基因植物中通过报告基因对生理周期节奏的研究；凝胶成像分析等等。 但在研究过程中，研究者们必须事先用基因技术进行荧光素酶基因标记，或者某种荧光报告基团标记。目前活体光学成像系统的知名制造商，如Berthold、GE、Xenogen、Photometrics、Carestream Health等，不仅为客户提供先进的仪器，也提供具体实验所需的整套解决方案，包括试剂、实验手册、特殊用途的质粒、细胞株、转基因动物、细胞处理和动物处理设施等配套技术支持。出色的多任务处理能力，人性化的整体设计，便捷精确的操作系统，使实验室影像分析领域进入了一个全新的时代。 下面以研究干细胞活体移植后的存活率为例，简介一两种内源性荧光色素标记的实验方法，供专业人士参考。 用荧光色素DiD标记 间充质干细胞 1. 先用胰蛋白酶消化待标记材料，使之成为一定密度的悬浮液； 2. 从细胞培养箱中取出间充质干细胞，吸取含原有培养基的细胞悬浮液进行标记； 3. 用10 ml Mg/Ca-free PBS （不含钙镁离子的磷酸缓冲液）清洗细胞，吸去PBS， 钙镁离子会影响胰蛋白酶的活性，必须小心； 4. 加入预热的0.05% 胰蛋白酶液，加液量以T75型瓶为例，每瓶加5ml， 确保瓶的表面被完全覆盖； 5. 在细胞培养箱中37° C 孵育约 5 分钟； 6. 然后在显微镜下确认细胞已经完全分散，如果有细胞贴壁情况，轻拍若干次或延长孵育时间直至酶解消化完全成功； 7. 加入等量含 10% FCS的培养基中和胰蛋白酶； 8. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散； 9. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中； 10. 400 RCF离心5 分钟； 11. 小心移去上清液，不要扰动细胞； 12. 将细胞重新悬浮于DMEM 并进行计数； 13. 需要待标记细胞在无血清DMEM溶液中的密度应为1x106 /ml ； 14. 每ml细胞悬浮液加入5 ?L DiD 染色液； 15. 用移液器将染色液与细胞悬浮液混合均匀； 16. 在6孔低附着性细胞板上37 °C 孵育20分钟； 17. 孵育完全后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中； 18. 400 RCF离心5 分钟； 19. 小心移去染色液，不要扰动细胞； 20. 用PBS清洗细胞，用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散； 21. 重复洗三次； 22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性； 23. 可以进行活细胞成像了！ 用荧光色素ICG标记 人胚胎干细胞 1. 必须先准备好吲哚菁绿溶液（血容量、心输出量、肝功能测定剂）作为对照品 ，然后使之与转染试剂鱼精蛋白（抗凝血作用）混合； 2. 测出1ml吲哚菁绿溶液的活力，然后在100 ?L DMSO中溶解ICG； 3. 向混合物中加入 400 ?L Dulbecco的改良Eagles 培养基 (DMEM + 10% 胎牛血清)， 震荡均匀，吲哚菁绿溶液终浓度为2mg/ml； 4. 加入转染试剂鱼精蛋白，鱼精蛋白作为对照品的载体，使之能够有效进入细胞； 5. 在300 ?L ICG 和 300 ?L 无血清Dulbecco改良 Eagles 培养基中混入 5 ?L 硫酸鱼精蛋白溶液, 使之终浓度为 10mg/ml,； 6. 震荡5分钟使之形成复合物，标记溶液制备完毕； 7. 从 hESC 10mm Petri 培养皿中移去原有培养基； 8. 加入5ml预热的 DMEM； 9. 加入制备好的鱼精蛋白/ICG 溶液， 37 °C下孵育1h； 10. 孵育完全后移去染色液； 11. 用5 ml PBS漂洗培养皿以清除染色液； 12. 移去 PBS 再加入 5ml 0.25 % 胰蛋白酶液，37 °C下孵育5分钟使之酶解，适当震摇培养皿效果会更好； 13. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散； 14. 加入等量含 10% KSR的培养基中和胰蛋白酶； 15. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中，400 RCF离心5 分钟； 16. 在全培养基中悬浮细胞； 17. 如果还有细胞团块，可以移去原有培养基用10ml预热的全ESC培养基重新悬浮细胞，重复酶解再离心； 18. 在这一点上，鼠源饲喂细胞需从hESCs中分离； 19. 然后将细胞悬浮液移至涂布琼脂的10 cm 培养皿中； 20. 37 °C 孵育 45 分钟，注意不要晃动培养皿，如此鼠源饲喂细胞会贴壁而干细胞保持悬浮； 21. 从Petri 培养皿中移出已标记的单细胞人胚胎干细胞悬浮液； 22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性； 23. 可进行活细胞成像了！