细胞荧光计

紧急求助，感激万分：用荧光探针Fura-2/AM 测细胞内钙离子浓度，可以用单波长的荧光分光光度计么？查资料，上面多用 双波长荧光分光光度计，一般是（岛津日本RF_5000型双波长紫外荧光分光光度计） ，我测得是细胞内的钙离子浓度，用的探针是 Fura-2/AM , 激发峰波长：340nm和380nm。我们实验室只有 美国瓦里安的Cary Eclipse型号的荧光分光光度计，而且没有340nm与380nm的滤光片， 请问可以测么？请大家指教！ QQ ：174690800 E-mail : whl5218@163.com 13775536885

（1）细胞核的分离： 将培养的细胞制成细胞混悬液，或以胰蛋白酶消化法于培养盖上收集培养细胞。应用MgSO4染色分离方法分离细胞核（Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章　）。细胞混悬液浓度为5×106/ml。利用RNA酶消化后，使核从细胞分离，细胞核混悬液浓度为4～5×106细胞核/ml。（2）细胞固定和酸的处理：在5 ml试管内加冷的100%酒精不断旋转以达到满意的固定。在冰上停留10 min。在4 ℃离心（×150 g）10 min。重复加三次冷的100%酒精入试管内，离心，倾去。置于冰上10 min，再离心。然后加入相当核悬液1/2量的0.1 n HCl , 0.5% Triton X-100。室温停留10 min。加入IBM-0.25%Triton X-100（IBM配方：50 mmol/l KCl, 10 mmol/L MgSO4, 5 mmol/L HEPES pH8.0）。再离心，重复IBM漂洗（这时细胞核可在不染色情况下，以荧光显微镜观察）后，以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min，继之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5 mmol/l MgSO4。在室温静置站立10min。倾去上清液，加IBm -Triton X-100漂洗，离心，使细胞核混悬液最终浓度为108/ml，（可用IBM-Triton X-100稀释约50倍，在血球计数器计数），混悬液镜检应含单个，完整的细胞核。（3）细胞核混悬液杂交①配制杂交混合液：甲酰胺5份，20×SSC1份，50%硫酸葡聚糖2份，pH调至7.0。此原液（stock solution）可贮存在4 ℃冰箱内。应用时加1份10 mg/ml鲱鱼精子DNA（herring sperm DNA）。②混合1 μl的细胞核混悬液（108/ml）与18μl的杂交混合液，充分混匀。将此19 μl混合液移入1.5 ml容积的Eppendorf 管中（核含量约为105）。③加入100 ng/每管的AAF标记DNA探针（如为生物素标记DNA探针浓度为20～40 ng/每管）。④置70 ℃10min使DNA探针和核DNA变性。⑤和组织切片与DNA探针杂交方法相较，不同的是在加热变性后切勿置冰上迅速冷却以终止反应，而应迅速转入37 ℃孵育过夜。（4）杂交后漂洗在每管中加入1.25 ml 50%甲酰胺-2×SSC（pH7.0），在42 ℃静置10～15min。偶尔旋转以助混匀。冷却至室温。加100 μl经dimethylsuberimidate(DEMS)处理的血细胞（107/ml）混匀，离心，室温，10min，轻弹试管使沉淀的小块散开，加入1.25 ml 2×SSC(pH7.0)，42 ℃，继之，静置于室温10～15min，如前离心，再加1.25 ml IBM-Triton X-100,室温静置5min，离心。注：DEMS处理红细胞方法：经漂洗并离心去除白细胞和血清的红细胞在盐液如PBS中，细胞含量为108/ml，以K2CO3和DEMS溶液处理3次，第1次：K2CO3为20 mmol/L,DEMS为3 mmol/L，以后2次：K2CO3依然为20 mmol/L，而DEMS为10 mmol/L。在应用前将K2CO3和DEMS液混合加入红细胞混悬液中。在最后2次漂洗液中，应用100 mmol/l K2CO3将pH调至9～10。在25 ℃，15min后，加入50 μl，100 mmol/l 的柠檬酸（citric acid）/每ml细胞混悬液的浓度以达固定红细胞的目的。固定的红细胞离心倾去上清液后，用2×SSC稀释到108/ml，加0.1%叠氮钠可在4 ℃保存至少1年。（5）AFF标记的荧光显示：加200 μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清（NGS），轻轻振荡混匀，室温静置10min，加20 μl 1：100的单克隆抗AFF抗体，37 ℃孵育45min，加1.25 ml的PBS-Tween，室温静置10min，加20间歇性振荡，离心，倾去上清液，加200 μlPBS含0.05%Tween –2%NGS,振荡，室温静置10min，加20 μl的羊抗小鼠–FITC荧光标记抗血清，稀释度1：100～1：300。孵育于37 ℃ 45min，加1.25 ml PBS –Tween,室温静置10min，离心，倾去上清液。（6）生物素标记探针的荧光显示：加200 μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室温静置10 min后，加20 μl抗生物素标记FITC抗血清15 μg/ml，孵育在37 ℃ 30min，以1.5 ml 4×SSc –0.1% Trion X-100洗1次，加入1.25 ml IBm –Triton X-100,室温静置10～15min，间歇振荡、离心。（7）荧光显微镜观察：将细胞核混悬液稀释于250 μl的IBM-Trion X-100中，轻加振荡混匀。为抗荧光褪色可加等量的抗褪色溶液至载片上的细胞核涂片上，选择适当的激发波长观察。（8）流式细胞计：将750 μl的细胞核混悬液通过流式细胞仪（Flow cytometry, FCM），DEMS处理过的红细胞作为对照（Df 530/30nm, Omega ·Optical Inc, Brattleboro, VT）。

如题，立F-4500荧光分光光度计是否能对细胞内EGFP进行定量分析？我向Hela细胞中转入了绿色荧光蛋白，想对绿色荧光蛋白的表达量进行定量分析。不知道用荧光分光光度计是否可行？谢谢！[color=red][I]疯子哥提示：由于你发的内容与GC无关，已经将其转到对应的版面，谢谢参与！[/I][/color]

有望提供一种新的治疗癌症的方法2013年08月01日 来源： 科技日报 作者： 陈丹 科技日报讯（记者陈丹）据《自然》杂志网站8月1日（北京时间）报道，纳米钻石可用于量子计算机中处理量子信息，而哈佛大学的研究人员利用纳米钻石的量子效应，将其变为“温度计”，测量出了人类胚胎干细胞内部的温度变化，精确度是现有技术的10倍。通过加入金纳米粒子，研究人员还能够利用激光对细胞的特定部分加热甚至杀死细胞，这有望提供一种新的治疗癌症而不损害健康组织的方法，以及研究细胞行为的新手段。研究论文发表在本周的《自然》杂志上。 在这项最新研究中，研究人员使用纳米线将直径约100纳米的钻石晶体注入一个人类胚胎干细胞中，然后用绿色激光照射细胞，使氮杂质发出红色荧光。当细胞内局部温度出现变化时，红色荧光的强度会受到影响。通过测量荧光的强度，便可以计算出相应的纳米钻石的温度。由于钻石具有良好的导热性，就可以像温度计一样显示出其所处细胞内部环境的即时温度。 研究人员同时还将金纳米粒子注入细胞内，然后用激光来加热细胞的不同部位，加热点的选择和温度升高多少都可由纳米钻石“温度计”来精确控制。“现在我们有了一个可以在细胞水平上控制温度的工具，让我们能够研究生物系统对温度变化的反应。”参与该研究的哈佛大学物理学家彼得·毛瑞尔说。 他指出，基础生物学涉及到的很多生物过程，从基因表达到细胞新陈代谢，都会受到温度的强烈影响，纳米钻石“温度计”将是一个有用的工具。例如，通过控制线虫的局部温度，生物学家可以了解简单有机体的发育。“你可以加热单个细胞，研究其周围的细胞是否会减慢或者加快它们的繁殖率。”毛瑞尔说。 目前也有一些其他测量细胞温度的方法，比如利用荧光蛋白或碳纳米管，但这些测量手段在敏感性和准确度方面都有欠缺，因为其中的一些成分会和细胞内的物质发生反应。毛瑞尔说，他们的纳米钻石“温度计”的敏感度至少提高了10倍，能够检测出细微到0.05开的温度波动。而且其还有改进的余地，因为在活细胞外部，该“温度计”的敏感度已经达到0.0018开的温度波动。 总编辑圈点 这样的“温度计”应该造价不菲，好在钻石是纳米级的。而其能够检测出细微到0.05开的温度波动，让其他测量细胞温度的方法难以望其项背，我们有理由相信，这项技术不仅仅只应用于医学领域。目前晶体管已经达到极小量度，在20或30纳米级别，离原子级别已经不远。然后，最重要的事情就是要理解热量散播和设备电子结构之间的关系，只有掌握这方面的知识，才能真正操控原子级设备，而纳米钻石“温度计”或许能派上大用场。 《科技日报》（2013-08-02 一版）

我要用荧光法测细胞中的钙离子浓度，首先要配制低浓度的钙离子缓冲液。但查了好多文献，也没找到合适简便的方法。请问各位有做这方面的吗？能互相讨论一下吗？我的QQ为472614473

[font=宋体]在生物医学研究和治疗领域，[/font][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-production][u][font=宋体][color=#0000ff][b][font=宋体]单克隆抗体（[/font][font=Calibri]mAbs[/font][font=宋体]）[/font][/b][/color][/font][/u][/url][font=宋体][font=宋体]扮演着越来越重要的角色。特别是在癌症和慢性疾病的治疗中，抗体的亲和力[/font][font=宋体]——即其与目标抗原结合的紧密程度[/font][/font][font=宋体]，[/font][font=宋体]直接影响[/font][font=宋体]抗体药物的[/font][font=宋体]治疗效果。因此，开发一种既准确又可靠的抗体亲和力测定方法，对于提高治疗效率和开发新型抗体药物至关重要。[/font][b][font=宋体]传统[/font][font=宋体]的亲和力测定[/font][font=宋体]技术[/font][/b][font=宋体]目前存在多种测[/font][font=宋体]定[/font][font=宋体]抗体亲和力的方法，如放射免疫[/font][font=宋体]分析[/font][font=宋体][font=宋体]、表面等离子共振（[/font][font=Calibri]SPR[/font][font=宋体]）、流式细胞术[/font][/font][font=宋体]、酶联免疫吸附分析和动力学排阻分析[/font][font=宋体]等[/font][font=宋体]。作为一种成功的候选治疗药物，[/font][font=宋体][font=Calibri]mAbs[/font][font=宋体]必须能识别目标抗原上的天然表位，因此需要一种更加快速灵敏、直观简便的测定方法。[/font][/font][b][font=宋体]基于细胞的荧光法：一种新的[/font][font=宋体]检测[/font][font=宋体]技术[/font][/b][font=宋体][font=Calibri]Yu[/font][font=宋体]等人在杜克大学医学中心的研究中，开发了一种基于细胞的荧光[/font][/font][font=宋体]检测[/font][font=宋体]法[/font][font=宋体]（如基于细胞的[/font][font=宋体][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]法[/font][/font][font=宋体]）[/font][font=宋体]，用于测[/font][font=宋体]定[/font][font=宋体][font=宋体]抗体亲和力。这种方法通过使用荧光标记的抗体，并将其加入到固定在[/font][font=Calibri]96[/font][font=宋体]孔板上的抗原阳性和抗原阴性的细胞系中，通过计算特异性结合和非特异性结合的差值来测量抗体的亲和力。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]研究者通过与传统的流式细胞术和放射性（[/font][font=Calibri]I[/font][/font][sup][font=宋体][font=Calibri]125[/font][/font][/sup][font=宋体][font=宋体]）[/font][font=Calibri]Scatchard[/font][font=宋体]分析方法进行比较，验证了基于细胞的荧光法的有效性。结果显示，新方法得到的解离常数[/font][font=Calibri]KD[/font][font=宋体]值与传统方法相当，证明了这一新技术的准确性和可靠性。[/font][/font][font=宋体]此外，研究还展示了如何使用这种荧光法进行竞争性结合分析，进一步验证了抗体与抗原的特异性结合。这一功能对于研究抗体的结合表位和选择高亲和力抗体具有重要意义。[/font][b][font=宋体]基于细胞的荧光法的优势[/font][/b][font=宋体]与[/font][font=宋体]流式细胞术和[/font][font=宋体][font=Calibri]I[/font][/font][sup][font=宋体][font=Calibri]125[/font][/font][/sup][font=宋体]比色法等[/font][font=宋体]传统方法相比，基于细胞的荧光法具有多项优势。首先，该方法不使用放射性同位素，减少了实验的安全风险。其次，使用完整的细胞而非纯化的蛋白质，能够更真实地模拟抗体与天然抗原的相互作用。此外，该方法操作简便，成本低廉，适合高通量筛选，且能够在短时间内完成大量样本的分析。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]尽管基于细胞的荧光法具有诸多优势，但也存在一些局限性。例如，对于复杂样品的处理可能会产生非特异性结合，导致结果的误判。然而，随着技术的不断优化和发展，这些问题有望得到解决。[/font][font=宋体]尽管目前还未有人利用[/font][font=宋体]基于细胞的荧光法[/font][font=宋体]来评估抗体亲和力，但是其自身具备的优势[/font][font=宋体][color=#182026]表明[/color][/font][font='Segoe UI'][color=#182026]该方法具有作为抗体亲和力检测方法的潜力[/color][/font][font=宋体]，为抗体药物的开发和研究提供强有力的支持。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][/font][font=宋体]本篇[/font][font=宋体]文章[/font][font=宋体]由[/font][font=宋体]义翘神州[/font][font=宋体]编辑[/font][font=宋体]整理[/font][font=宋体]，[/font][font=宋体]同时[/font][font=宋体]义翘[/font][font=宋体]神州[/font][font=宋体]提供[/font][url=https://cn.sinobiological.com/services/spr-bli-assay-services][u][font=宋体][color=#0000ff][b][font=Calibri]SPR/BLI[/font][font=宋体]亲和力测定服务[/font][/b][/color][/font][/u][/url][font=宋体]，[/font][font=宋体]详情[/font][font=宋体]请[/font][font=宋体]点击[/font][font=宋体]！[/font][font=宋体][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]参考文献：[/font][font=宋体][font=Calibri]Yu X, Pegram CN, Bigner DD, Chandramohan V. Development and validation of a cell-based fluorescent method for measuring antibody affinity. J Immunol Methods. 2017 442:49-53. doi:10.1016/j.jim.2016.12.004[/font][/font][font=Calibri] [/font]

科技日报 2013年10月19日 星期六 科技日报讯 如果你问一个生物学家，某个细胞下一步会做什么？他可能先要问你该细胞的电压、氧化性、pH值、渗透性、葡萄糖浓度等等，然后才可能据此预测它是正要发起一个动作电位，还是要进入有丝分裂，抑或正在走向凋亡。但如果你能轻松地得到亚细胞范围的温度曲线图，比如每个线粒体、中心粒甚至内质网区的温度，就像母亲给孩子量体温那么容易，情况又会完全不一样。 据物理学家组织网10月16日报道，日本京都大学科学家最近将绿色荧光蛋白和沙门氏菌体内感受热量的一种蛋白融合在一起，制造出一种能检测细胞内部不同细胞器温度波动的基因编码“温度计”，并将细胞器温度变化与细胞内部功能联系在一起，有助于人们进一步理解细胞行为。相关论文发表在最近的《自然·方法学》杂志上。 制做这种新型“温度计”的关键，是一种已知的名为TlpA的蛋白，这种蛋白由沙门氏菌制造，其正常作用是作为一种自动调节抑制器，感知温度以控制转录，能在37℃左右进行迅速可逆的结构转录。研究人员把绿色荧光蛋白（GFP）的荧光片段与TlpA融合，使GFP的荧光光谱随温度变化，最后再把融合蛋白加入到能瞄准线粒体、内质网或细胞质膜蛋白的序列中。 这种以蛋白质为基础的新型热传感器还能通过基因编码，直接瞄准不同的细胞器，比如线粒体，同时测量膜蛋白和产生的能量，并在温度变化与细胞器的内部功能之间建立联系。在本实验中，研究人员能探测到褐脂肪线粒体的生热作用，并把温度与线粒体膜蛋白、三磷酸腺苷（ATP）生产联系在一起。 利用这种序列，他们能同时绘制出“感温”GFP随线粒体膜蛋白电压指示器JC-1的染色图。他们发现，在温度高的地方，电压也相应较高。他们还用另一种基因编码传感器（ATeam26）结合荧光共振成像（FRET）检测ATP，再次证实了这种相关性。ATP主要是在氧化磷酸化过程中由一种电化学泵产生的，反映了线粒体的质子变化曲线，与JC-1所指示的类似。 研究人员指出，这一技术充分发挥作用的最佳地方是脑细胞。它能更好地处理温度变化，不仅在轴突的内外，而且能在神经胶质细胞内部。胶质细胞包裹着髓磷脂，所以携带了脉冲能量的很大一部分，有助于人们更好地理解神经信号的传输。但这还有争议，脉冲神经元热动力学主要还是由实验驱动，而并非不太精确的外在温度传感器。（常丽君）

荧光显微镜下H526细胞的慢病毒转染结果

流式细胞胞仪的分析及分选原理流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和数字信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成。在对细胞悬液中的单个细胞或其超微结构进行多参数快速自动分析过程中，每秒钟能测量数千个至数万个细胞，能在分析过程中按实验设计要求对特定细胞进行分析，带细胞分选系统的流式细胞仪还可按实验设计要求分选出具相同特征的同类型细胞，用于培养或进一步研究。一、工作原理流式细胞仪的工作原理借鉴了荧光显微镜技术，将荧光显微镜的激发光源改为激光，使其具有了更好的单色性与激发[/

[font=DengXian]请问国内有开发流式细胞仪试剂的厂商？[font=DengXian]我们是荧光染剂的厂商，想找抗体公司合作评估开发试剂。[/font][/font]

近日，美国麻省理工学院利用造价低廉的激光开发出一种从样品中分离某些细胞的新系统。该系统能在普通的玻璃载玻片上分离出1万多种细胞，这将有助于研究人员轻松完成许多在以前看来不可能的生物实验。而且，与其他细胞分离方法相比，该系统分离速度快、操作简单且价格便宜。这一研究结果刊登在12月15日的《分析化学》（Analytical Chemistry）上。 此前，细胞分离系统都是将样品与可跟特定蛋白质或其他成分反应的标记物混合，然后根据样品是否发出荧光来分离细胞。新系统将根据细胞中某些特定部分的反应来进行更加细致的细胞分离。另外，系统还能根据反应速度的快慢以及持续时间的长短来分离细胞，而用传统分离办法完成这些工作是不可能的。 新系统仅利用一个固定在普通玻璃载玻片上的透明有机硅薄层。硅层中分布了很多小空穴，使样品溶液中的细胞能沉淀在其中。经过如此改装的载玻片就能帮助研究人员分离出上万个细胞。 通过显微镜，研究人员或计算机系统能仔细察看细胞是否在特定区域或时间发出荧光。一旦发现发出荧光的细胞，计算机将自动记录其位置。然后，所有被记录下来的细胞将在激光束的作用下从空穴中浮出，最后这些细胞经液体冲刷后就可收集到容器中。 该系统的研发人员称，用激光束使细胞从空穴中浮出来，就像用消防管的水推动一个充气球。但激光的作用非常轻柔，不会使细胞受到损伤。 与光镊等昂贵的分离技术不同，这个系统的成本仅为几千美元，因此可广泛应用于生物实验室和临床研究机构。研究人员预计，该系统将在临床试验与诊断、基因筛选以及克隆研究等方面发挥重要作用。（来源：科技日报 徐玢） （《分析化学》（Analytical Chemistry），79 (24), 9321 -9330, 2007. 10.1021/ac071366y S0003-2700(07)01366-2，J. R. Kovac and J. Voldman）

慢病毒转染过后的细胞荧光照片明场[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/06/202306302120455921_65_5389809_3.jpeg[/img]低浓度[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/06/202306302120459963_6495_5389809_3.jpeg[/img]高浓度[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/06/202306302120461778_5983_5389809_3.jpeg[/img]

一、对照组的设置：在流式细胞术中所测得的量都是相对值，不是绝对值。如需知道绝对值 时必须设置对照组样品。对照组样品包括有阴性对照和阳性对照。1. 阴性对照的设置① 在实验过程中，如做间接标记法，可设置与一抗无关的实验，即在 实验中不加一抗而只加上带有荧光标记的第二抗体作为阴性对照 管，作为阴性对照。② 在实验过程中，假设做直接标记法，可设置理论上的阴性细胞作为 阴性对照管， 实验过程及步骤与实验组务必相同。 （做间接标时记，法 同样也可同时设置“阴性细胞”的阴性对照管作为阴性对照。③ 在实验过程中，假设做直接标记法，可将实验组细胞，取一管，加上与实验抗体所标记的荧光颜色相同的同型对照来作为阴性对照。2. 阳性对照的设置：在实验过程中如涉及到表达缺失或减少的实验，应设置阳性对照组，其设置方法与阴性对照设置相同。二、几点建议：1. 在实验过程中，在保证实验的科学性和准确性的基础上，应尽量减少实验工 序和过程。由于间接标记法的工序多，实验过程长，如再加之操作的不熟练， 细胞更容易丢失和受损，而造成实验结果的误差。因此，在条件允许的范围 内，建议尽量做直接标记法而不去做间接标记法，以保证实验的真实性和准 确性。2. 建议送检细胞一定要足够量，一般要求 1×106 个细胞。不要过少。因为，如 细胞太少检测时样本流量相对会增大从而影响变异系数，结果也不可信。细 胞量也不宜过多，因细胞量太多加入的抗体或染料相对不足，结果也由此受影响。3. 同一种细胞需同时做双标记时，须做双标记的同型对照，且两种抗体所标记 的荧光颜色务必不同

六. 流式细胞仪主要构造和工作原理 信号检测系统 当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分为前向角散射（Forward Scatter, FS）和侧向角散射或900散射（Side Scatter, SS）,散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备（如染色）无关;荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光，它是我们要测定的荧光,荧光信号较强,这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由,以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。前向角散射（FS）反映被测细胞的大小,它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号；侧向角散射或900散射（SS）反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状, 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号,这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm）。488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。他们的激发光和发射光波长分别是： [/col

流式细胞术是一项基于激光和免疫荧光的单细胞检测技术。当带有荧光标记的细胞或其它颗粒流动通过检测点时，激光与荧光素分子相互作用，产生的光信号可以定性或定量的表征细胞中被标记的成分。由于细胞的特异性主要由

用途： 流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是说，它的细节 分辨率为零。 流式细胞仪主要由四部分组成。它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统 参数测量原理荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。在免疫细胞化学等测量中，对于结合水平不高的荧光抗体来说，如何提高信噪比是个关键。一般说来，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子（例核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。　　减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是：①尽量选用较亮的荧光染料；②选用适宜的激光和滤片光学系统；③采用电子补偿电路，将自发荧光的本底贡献予以补偿。仪器的操作和使用　　①打开电源，对系统进行预热；　　②打开气体阈，调节　压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统；　　③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统；　　④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0和90散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小；　　⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程；　　⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统；　　⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量更大），因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理；　　⑧将所需结果打印出来。热销细胞网是采用Accuri 型2号流式细胞仪，指示符®软件和工作站电脑供应在对市场价格领先的系统的一小部分的功能齐全的流式细胞仪的所有功能。在C6系统包括蓝色和红色激光，四色探测器和正向和侧向散射检测器加上软件，非常直观，你通常将和内收到您的Accuri小时运行的系统。

激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图像分析仪器，与传统的光学显微镜相比，大大地提高了分辨率，能得到真正具有三维清晰度的原色图像。并可探测某些低对比度或弱荧光样品，通过目镜直接观察各种生物样品的弱自发荧光。能动态测量Ca2+ 、pH值，Na+、Mg2+等影响细胞代谢的各种生理指标，对细胞动力学研究有着重要的意义。同时激光扫描共聚显微镜可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学特性的破坏，更接近细胞生活状态参数测定。可见激光扫描共聚焦显微镜是普遍显微镜上的质的飞跃，是电子显微镜的一个补充，现已广泛用于荧光定量测量，共焦图像分析，三维图像重建、活细胞动力学参数分析和胞间通讯研究等方面，在整个细胞生物学研究领域有着广阔的应用前景。1. 定量荧光测量ACAS可进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。利用这一功能既可对单个细胞或细胞群的溶酶体，线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份及分布进行定性及定量测定，还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态学特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息。2. 定量共聚焦图像分析借助于ACAS激光共焦系统，可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片，从而得到各层面的信息，三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生物化学特性的变化，如DNA含量、RNA含量、分子扩散、胞内离子等，亦可以对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析。3. 三维重组分析生物结构ACAS使用SFP进行三维图像重组，SFP将各光学切片的数据组合成一个真实的三维图像，并可从任意角度观察，也可以借助改变照明角度来突出其特征，产生更生动逼真的三维效果。4. 动态荧光测定Ca2+、pH 及其它细胞内离子测定，利用ACAS能迅速对样品的点，线或二维图像扫描，测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率，使用诸如Indo-1、BCECF 、Fluo-3等多种荧光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率，能定量测定细胞溶液中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应，以及使用双荧光探针Fluo-3和CNARF进行Ca2+和pH的同时测定。5. 荧光光漂白恢复（FRAP）——活细胞的动力学参数荧光光漂白恢复技术借助高强度脉冲式激光照射细胞某一区域，从而造成该区域荧光分子的光淬灭，该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过ACAS可直接测量分子扩散率、恢复速度，并由此而揭示细胞结构及相关的机制。6. 胞间通讯研究动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要的作用。ACAS可用于测定相邻植物和动物细胞之间细胞间通讯，测量由细胞缝隙连接介导的分子转移，研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用，以及胞内Ca2+、PH和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。7. 细胞膜流动性测定ACAS设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性，因此极性测量间接反映细胞膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点，温度反应测定和物种比较等方面有重要作用。8. 笼锁-解笼锁测定许多重要的生活物质都有其笼锁化合物，在处于笼锁状态时，其功能被封闭，而一旦被特异波长的瞬间光照射后，光活化解笼锁，使其恢复原有活性和功能，在细胞的增值、分化等生物代谢过程中发挥功能。利用ACAS可以人为控制这种瞬间光的照射波长和时间，从而达到人为控制多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。9. 粘附细胞分选ACAS是目前唯一能对粘附细胞进行分离筛选的分析细胞学仪器，它对培养皿底的粘附细胞有两种分选方法： ① Coolie-CutterTM法，它是Meidian公司专利技术，首先将细胞贴壁培养在特制培养皿上，然后用高能量激光的欲选细胞四周切割成八角形几何形状，而非选择细胞则因在八角形之外而被去除，该分选方式特别适用于选择数量较少诸如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞，即使百万分之一机率的也非常理想。 ② 激光消除法，该方法亦基于细胞形态及荧光特性，用高能量激光自动杀灭不需要的细胞，留下完整活细胞亚群继续培养，此方法特别适于对数量较多细胞的选择。10. 细胞激光显微外科及光陷阱技术借助ACAS可将激光当作“光子刀”使用，借此来完成诸如细胞膜瞬间穿孔、切除线粒体、溶酶体等细胞器、染色体切割、神经元突起切除等一系列细胞外科手术。通过ACAS光陷阱操作来移动细胞的微小颗粒和结构，该新技术广泛用于染色体、细胞器及细胞骨架的移动。

[b][url=http://www.f-lab.cn/cell-analyzers/puncher.html][b]单细胞转移分离系统[/b][/url]是可用于单细胞转移,单细胞分离和单细胞隔离,单细胞成像应用的多功能单细胞分离操作仪器,它可以实现从微孔芯片转移单细胞到细胞收集管中。单细胞转移分离系统[/b][color=#666666]集单细胞成像,单细胞隔离,单细胞选择功能于一体,自动聚焦成像。[/color][b]单细胞转移分离系统转移单细胞到Eppendorf微管，PCR微孔板或其它反应微管中,[/b][color=#666666]在隔离单细胞后，它可以对选定收集的细胞进行扫描并成像。[/color][b]单细胞转移分离系统[/b][color=#666666]采用Nikon Ti-2倒置荧光显微镜,配备自动扫描显微镜载物台,自动聚焦器件,高灵敏度荧光CCD相机和LED激发光源组建而成。[/color][img=单细胞转移分离系统]http://www.f-lab.cn/Upload/single-cell-isolation.JPG[/img][b]单细胞转移分离系统[/b]特点完全自动化，步进系统高质量单细胞荧光成像单细胞分离的效率超过90% 超过70%分离的细胞增殖 分离后兼容所有的单细胞的WGA工具包（放大器的‐1，picoplex，复制‐G）实惠微Wells基于硅微孔微腔。由薄膜封闭70µ m，井底直径（1µ m），包含一个单孔。样品流体进入威尔斯并从底部的孔隙中流出。单个细胞被拖着走。一旦单个细胞降落到孔隙上，流动停止，其他细胞就不会进入井内。有用的细胞被识别出来。选定的细胞穿孔从微孔到384孔PCR板或离心管等等。单细胞转移分离系统：[url]http://www.f-lab.cn/cell-analyzers/puncher.html[/url]

[b][url=http://www.f-lab.cn/cell-analyzers/ctc-enumeration.html]CTC细胞计数成像系统[/url][/b]集细胞荧光成像和罕见细胞计数功能于一体,自动聚焦成像，能够探测超级罕见细胞,包括[color=#333333]循环肿瘤[/color]细胞(Circulating Tumor Cells, CTCs),CTCs细胞。CTC细胞计数成像系统采用Nikon Ti-2倒置荧光显微镜,配备自动扫描显微镜载物台,自动聚焦器件,高灵敏度荧光CCD相机和LED激发光源组建而成。[img=CTC细胞计数成像系统]http://www.f-lab.cn/Upload/CTCs-enumeration.JPG[/img][img=CTC细胞计数成像系统]http://www.f-lab.cn/Upload/CTC-enumeration.JPG[/img]CTC细胞计数成像系统：[url]http://www.f-lab.cn/cell-analyzers/ctc-enumeration.html[/url][b][/b]

摘要：细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。1. 光学显微镜和倒置显微镜(1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。(2) 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。2. 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1）。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376278_small.jpg3 透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376295_small.jpg二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376296_small.jpg方法1. 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(0.5~1×106)用PBS洗2次，加入100 ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10 ul，室温避光30 min，再加入PI(50 ug/ml)5 ul，避光反应5 min后，加入400 ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1 h)， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。2. 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。3. 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。结果 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376298_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376300_small.jpg

流式细胞仪(Flow cytometer, FCM)是70年代发展起来的对单个细胞进行定性定量测定的新型仪器，亦称荧光激活细胞分类仪(FACSC)，是一种将现代免疫荧光技术与流体力学、激光学、应用电子学和计算机等学科的先进技术相融合用于基础与临床细胞生物学研究的一项高科技实验检测仪器。它能在一定功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测到多个参数。与传统的荧光镜检测相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。流式细胞仪以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特点，已在医学、生物学的几乎所有领域里得到迅速的推广，并在各学科研究中发挥着重要的作用。我的这片文章9月发表，等正式发表了，我贴出来，需要的话可联系我shuguangfang@tom.com

北京和睦家医院 孙芾　王厚芳 流式细胞术(FCM)是70年代初发展起来的一项高新技术，80年代开始从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。我国在80年代初引进了第一台流式细胞仪，到目前在医学院校、科研机构和医院已经有100多台。　　 FCM采用流式细胞仪对细胞悬液进行快速分析，通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。FCM综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、生物学、免疫学以及激光和计算机等多门学科和技术，具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点，还有对所需细胞进行分选等特殊功能。随着该仪器性能的不断完善，操作简单的各新型流式细胞仪相继问世。新试剂的不断发现使试验费用日益降低，FCM也从研究室逐步进入临床实验室，成为常规实验诊断的重要手段，不仅为临床提供了重要的诊断依据，也使检验科室的诊断水平、实验技术提高到一个新的高度。

第 一 部 分 流式细胞术的一般介绍概念流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞仪（Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞仪特点[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2008/11/200811302229_121122_1769204_3.gif[/img]

[font=宋体][font=宋体]在生物学和医学研究中，细胞增殖是一个关键过程，对于理解生命活动的基本规律以及疾病的发病机理具有重要意义。随着科技的发展，流式细胞仪作为一种高效、灵敏的分析工具，广泛应用于细胞增殖的检测。流式细胞仪通过快速分析单个细胞，可以对细胞周期、细胞增殖活性、细胞凋亡等多个方面进行研究。本文将探讨流式细胞仪在检测细胞增殖方面的主要方法，包括但不限于溴脱氧尿苷（[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]）掺入法、细胞周期蛋白检测法以及细胞大小分析法等，以期为读者提供全面的技术应用概览。流式细胞仪检测细胞增殖方法：[/font][/font][b][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]3H[/font][font=宋体]（氚离子）掺入法[/font][/font][/b][font=宋体][font=宋体]原理：是在细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成时，用[/font][font=Calibri]3H[/font][font=宋体]脱氧胸腺嘧啶核苷代替普通的脱氧胸腺嘧啶核苷掺入新合成的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]中，增殖的细胞因为掺入[/font][font=Calibri]3H[/font][font=宋体]而具有放射性，通过定量检测样品细胞的放射性大小而反映细胞的增值活性[/font][/font][font=宋体][font=宋体]缺点：[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）使用的是具有放射性的同位素，操作较为复杂，同时需要采取放射性保护措施 [/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）低比例高活跃增殖和高比例低活跃增殖可能得到的是相同的结果，用此方法无法进行鉴别 [/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）此方法无法进一步得到具有活性的增值细胞用于下一步的研究 [/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]） 此方法时间较短，无法检测加入前细胞的增殖情况，而且检测到放射性只能说明细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成，而不能提供合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的细胞是否进入增殖阶段的信息[/font][/font][b][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、相对计数法[/font][/font][/b][font=宋体]原理：将对照组和各实验组控制在相同条件下直接计数然后比较计数结果得到增殖结论[/font][font=宋体]注意点：[/font][font=宋体][font=宋体]对照组与实验组每种细胞所加浓度必须相同，每组至少设置[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个复孔，这样每个孔可以得到[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]个细胞数，将[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个复孔取平均值后就是这个组的结果。如果同时需要得到每孔目标细胞增殖后的绝对参数，在每孔细胞中加入[/font][font=Calibri]1*105PE[/font][font=宋体]标记的人工微球作为内参[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]收集各组的细胞于[/font][font=Calibri]EP[/font][font=宋体]管中，注意必须尽量将各组的所有细胞都收集起来。标记需要计数细胞的标志表型的荧光素偶联抗体，[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃静置[/font][font=Calibri]30min[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]洗涤一次，洗去游离的抗体[/font][/font][b][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、示踪染料标记法[/font][/font][/b][font=宋体][font=宋体]示踪染料与细胞结合的方式：[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）能够与细胞内的蛋白质上的氨基发生非特异性的共价结合 [/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）能够非特异性地嵌入细胞膜的脂质双分子层中与细胞发生非共价性结合[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]原理：示踪染料的荧光信号都很强，当细胞分裂时，母细胞内的染料会被平均分配到子细胞中，细胞荧光信号会被减弱一半，所以通过检测减弱的、发射示踪染料荧光信号的细胞比例就可以判断细胞增殖的强弱。当荧光强度减弱到标记时的[/font][font=Calibri]1/2[/font][font=宋体]以及以下的细胞都是增殖后的细胞，这些细胞所占比例越高则代表细胞增殖越活跃[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]标记方法：[/font][font=宋体][font=宋体]①纯化增殖反应的目标细胞，将细胞的浓度调整为[/font][font=Calibri]1*106/ml[/font][font=宋体]，加入[/font][font=Calibri]CFSE[/font][font=宋体]，其标记浓度为[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]微摩尔[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]升。置于[/font][font=Calibri]37[/font][font=宋体]℃水浴中标记[/font][font=Calibri]15min[/font][font=宋体]，在标记过程中每隔一段时间混匀细胞一次[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②加入预冷、含有血清的培养基终止标记，在[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃冰箱中静置[/font][font=Calibri]5min[/font][font=宋体]，离心沉淀[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③用培养基再洗涤一次，尽量洗净未结合的游离的[/font][font=Calibri]CFSE[/font][font=宋体]，然后将目标细胞静置在增殖体系中[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]EdU[/font][font=宋体]掺入法[/font][/font][/b][font=宋体][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]：[/font][font=Calibri]5-[/font][font=宋体]溴脱氧尿嘧啶核苷是胸腺嘧啶核苷的类似物，其特点是胸腺嘧啶环上[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]位[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]连接的甲基被溴取代，在细胞增殖[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成时可以与内源性的胸腺嘧啶核苷竞争掺入到新合成的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]中，而[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]抗体可以特异性的识别[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]，不与胸腺嘧啶核苷结合，所以可以用于检测细胞增殖[/font][/font][font=宋体][font=宋体]适用范围：适用于体内检测目标细胞的增殖，一般将[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]掺入小鼠的应用水中或经腹腔注射，经过一段时间后，取出目标细胞制成单细胞悬液然后用多聚甲醛固定细胞，后用打孔剂皂苷在细胞膜上打孔，最后标记荧光素偶联抗[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]抗体，目标细胞的[/font][font=Calibri]BrdU[/font][font=宋体]阳性细胞就是增殖的细胞，阳性比例越高，增殖越活跃。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、其他方法[/font][/font][/b][font=宋体][font=宋体]细胞周期法检测细胞增殖：流式细胞术能够检测细胞内[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的含量，所以可以检测细胞周期。处于[/font][font=Calibri]S[/font][font=宋体]期的细胞，[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的量处于二倍体和四倍体之间[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]处于[/font][font=Calibri]G2/M[/font][font=宋体]期时，[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]量为四倍体。处于[/font][font=Calibri]S[/font][font=宋体]期和[/font][font=Calibri]G2/M[/font][font=宋体]期的细胞比例越高说明细胞增殖越活跃[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]PCNA[/font][font=宋体]检测细胞增殖：[/font][font=Calibri]PCNA[/font][font=宋体]（增殖细胞核抗原），在细胞核合成且只存在于细胞核内，是[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]聚合酶的辅助蛋白，所以与细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的合成关系密切，是反映细胞增殖状态的良好指标[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Ki-67[/font][font=宋体]检测细胞增殖：是一种与细胞增殖特异相关的核抗原[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]CD71[/font][font=宋体]检测细胞增殖：是转铁蛋白受体，表达于细胞的表面，该受体广泛表达于各种恶性肿瘤细胞表面，正常细胞表达较少，与肿瘤细胞的增殖密切相关[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service][b]流式细胞检测技术服务[/b][/url]，更多关于流式细胞仪检测细胞增殖详情欢迎咨询，详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

[align=center][size=24px]流式细胞仪监测适配体与靶细胞的结合[/size][/align][align=center]肖书棋 18122884967[/align][align=center][/align]本次说明是基于核酸适配体能与靶标进行特异性结合的原理，利用流式细胞仪监测适配体与靶细胞的结合状况，还能比较不同适配体与靶细胞之间的结合强度的比较；本次所使用的流式分析仪是BD FACSAria III。[font='times new roman'][size=16px]1.原理介绍：[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.1核酸适配体：[/size][/font]核酸适配体(Aptamer，Apt）：是一段寡核苷酸序列（ssDNA或RNA），是利用指数富集的系统进化技术（the Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）在多样寡核苷酸序列的文库中，进行体外筛选得到。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111301026239049_1528_5413603_3.jpeg[/img][/align][align=center][size=13px]Aptamer结合靶标原理[/size][size=13px]图[/size][/align]如图所示，在合适的缓冲液环境下，单链寡核苷酸序列具有弯曲以及折叠成特定的三级空间结构的能力，该结构可以与靶分子特异性结合，SELEX技术就是应用该原理来进行选择的。将信息量巨大且随机的的寡核苷酸文库与靶标孵育，经过多轮的优胜劣汰和PCR扩增，最后得到能与靶标高亲和力性结合的寡核苷酸序列，即核酸适配体(Aptamer)。由于核酸适配体具有靶向特异性的特点，因此应用广泛；那么如何监测适配体靶向细胞亲和力的方法，就需要用到流式细胞术进行表征。[font='times new roman'][size=16px]1.2流式细胞仪原理：[/size][/font]流式细胞术能够快速检测细胞或者生物颗粒的特征，其检测灵敏，能够定性或者定量分析颗粒的参数，还具有细胞分选的功能，功能强大，分析参数多，实用性较强。流式细胞仪（flow cytometer，FCM）的设计应用了光学、细胞化学、电子学等技术，拥有较强大的细胞及微粒分析功能，在临床医学、免疫学、微生物学等等研究领域发挥着巨大的作用。流式分析可以检测细胞表面颗粒复杂程度、核酸以及蛋白质的含量、细胞表面积或者细胞表面的抗体、细胞受体等等，在多种研究领域起到重要作用。在本研究中应用流式分析细胞荧光强度的基本步骤原理是：（1）制备成单细胞悬液：将待测细胞预处理进行荧光标记后制成单细胞悬液，通过气压将流式管中的细胞悬液通过管道压进流动室，同时喷出的鞘液将细胞包裹，形成圆形的鞘流，细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过流动室检测区域。（2）形成光散射：激发光源侧向垂直射向单个细胞，含有荧光的细胞形成两种光：①前向散射光（forward scatter， FSC）：激光束照射细胞时，光束偏移量较小（10°以内），散射至前方，可用于检测细胞等粒子的表面信息，颗粒体积越大，信号越强。②侧向散射光（side scatter，SSC）激光束照射颗粒，产生偏移角度为直角的散射光，可反应细胞内含物的信息。（3）光信号转化成电信号：光信号导入到计算机中，依次形成电信号，再转化为数字信息。应用FlowJo软件处理数据，可以获得相应的散点图、直方图等形式，便于直观分析。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111301026241158_6946_5413603_3.jpeg[/img][/align][align=center][font='times new roman'][size=13px]流式分析基本原理图[/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px]2.分析步骤：[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2.1细胞预处理：[/size][/font]通过流式分析预处理，可以使细胞在特定的环境，与带有FAM荧光的适配体进行特异性结合，通过平行实验使细胞与不同的适配体文库进行标记，最终表征其荧光强度，进行亲和力的分析与比较。如表所示，流式分析条件为：[align=center][size=13px]流式细胞分析条件探寻[/size][/align][table][tr][td][align=center][size=13px][color=#000000]孵育时条件[/color][/size][/align][/td][td][size=13px][color=#000000]孵育时体积[/color][/size][/td][td=2,1][align=center][size=13px][color=#000000]孵育时浓度[/color][/size][/align][align=center][size=13px][color=#000000]细胞浓[/color][/size][size=13px][color=#000000]度 [/color][/size][size=13px][color=#000000]单链DNA浓度[/color][/size][/align][/td][td][align=center][size=13px][color=#000000]第二次洗涤用液[/color][/size][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][size=13px][color=#000000]4 ℃，30 min,BB,摇晃[/color][/size][/align][/td][td][align=center][size=13px][color=#000000]500 μL[/color][/size][/align][/td][td][size=13px][color=#000000]2.5×10^6个/mL[/color][/size][/td][td][align=center][size=13px][color=#000000]125 nM[/color][/size][/align][/td][td][align=center][size=13px][color=#000000]PBS x 2[/color][/size][/align][/td][/tr][/table]流式分析的大致步骤为：消化细胞、细胞与文库孵育、润洗重悬、上样分析。最终确定，初始的细胞悬液浓度为5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font] 个/mL，初始文库的浓度为250 nM；孵育时体系的总体积为250 L，细胞浓度为2.5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL，适配体浓度为125 nM，环境为4 ℃、30 min，震荡。最后上样的细胞悬液体积为500 L，细胞浓度为2.5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL。[align=left][font='times new roman'][size=16px]2.1.1材料准备：[/size][/font][/align][align=center][size=13px] 流式分析主要仪器与试剂[/size][/align][table][tr][td][align=center]名称[/align][/td][td][align=center]规格/型号[/align][/td][td][align=center]作用[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]流式细胞仪[/align][/td][td][align=center]FACSAria III[/align][/td][td][align=center]对细胞进行流式分析[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]可调式混匀仪[/align][/td][td][align=center]MX-S[/align][/td][td][align=center]混悬适配体悬液[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]震荡仪[/align][/td][td][align=center]MX-M[/align][/td][td][align=center]震荡孵育体系，防止细胞贴壁[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]制冷恒温金属浴[/align][/td][td][align=center]HX-20L[/align][/td][td][align=center]热击适配体，使核酸变性恢复到自由的无规则卷曲状态[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]显微镜[/align][/td][td][align=center]DMI1[/align][/td][td][align=center]观察细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]水浴氮吹仪[/align][/td][td][align=center]FY-DCY12S[/align][/td][td][align=center]加热试剂[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]电子天平[/align][/td][td][align=center]JA2003[/align][/td][td][align=center]称量药品[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]离心管[/align][/td][td][align=center]15 mL×10、50mL×10[/align][/td][td][align=center]分装试剂，装载需离心的细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]低吸附离心管[/align][/td][td][align=center]2 mL×20[/align][/td][td][align=center]装适配体悬液，减少适配体与细胞在管壁上的吸附[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]一次性使用吸管[/align][/td][td][align=center]3 mL×20[/align][/td][td][align=center]方便地吸取PBS[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]细胞刮刀[/align][/td][td][align=center]3010×1[/align][/td][td][align=center]刮下贴壁生长的细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]PBS[/align][/td][td][align=center]50 mL×2[/align][/td][td][align=center]ScienCell[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]Cell Dissociation Solution[/align][/td][td][align=center]100 mL[/align][/td][td][align=center]消化细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]0.25%Trypsin-EDTA[/align][/td][td][align=center]100 mL[/align][/td][td][align=center]Gibco[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1×PBS缓冲液[/align][/td][td][align=center]500 mL[/align][/td][td][align=center]润洗细胞，重悬细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]Cell Dissociation Solution[/align][/td][td][align=center]100 mL[/align][/td][td][align=center]消化细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]0.25%Trypsin-EDTA[/align][/td][td][align=center]100 mL[/align][/td][td][align=center]Gibco[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1×PBS缓冲液[/align][/td][td][align=center]500 mL[/align][/td][td][align=center]润洗细胞，重悬细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]无酶无菌水[/align][/td][td][align=center]500 mL[/align][/td][td][align=center]溶解适配体文库[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]DMEM高糖培养基[/align][/td][td][align=center]50 mL[/align][/td][td][align=center]停止消化[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]细胞[/align][/td][td][align=center]＞5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个[/align][/td][td][align=center]作为目的细胞进行流式表征[/align][/td][/tr][/table]①配置Binding buffer（结合缓冲液BB）：配置10 g/L BSA：称量0.1g BSA，溶于10 mL Washing Buffer，过膜；取上述溶液5 mL，加入到445 mL Washing Buffer中；再加入500 L鲑精DNA，混匀。②将U盘格式化，提前打开制冰机和金属浴（95℃）；③37℃水浴：将无酶消化液、ECM、PBS（1）放入37℃水浴。④4℃冰敷：向泡沫盒中加碎冰，离心管架、温度计，准备4℃孵育环境，放入PBS和BB预冷。⑤打开显微镜（酒精擦拭载物台）。⑥打开离心机：120 g，1 min，25℃。[align=left][font='times new roman'][size=16px]2.1.2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计数和文库预处理[/size][/font][/align]（1）细胞计数（20倍或者40倍显微镜）：①采用直接计数法，在显微镜中随机选择五个点进行计数取平均值，根据视野的面积以及T75培养瓶面积计算细胞总数，推出公式：Y为总细胞数；X为视野中细胞平均数；Y=27886.12X（20倍镜下）/Y=111111.11X（40倍镜下)。为了保证流式有足够的细胞，需要保证细胞总数＞5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL。②计算BB体积：V=Y/（2×10[font='times new roman'][size=16px]7[/size][/font]）mL，用V体积的BB重悬细胞沉淀，可获得细胞浓度为5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL的初始细胞悬液。（2）文库预处理：①将粉末状适配体文库进行离心：4000 r，5 min，4℃；使适配体粉末聚集在离心管底部，防止打开离心管时干粉状适配体飞出。②按照说明用一定体积的无酶无菌水溶解适配体，使适配体母液浓度在5 M。③取100 L母液，并加入900 LBB，使适配体浓度在500 nM。④再去上述液体500 L，并用BB稀释至浓度为250 nM，最终得到250 nM的适配体文库悬液。⑤95℃热击3 min，热击后放在泡沫盒中冰敷。[align=left][font='times new roman'][size=16px]2.1.3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞处理[/size][/font][/align]（1）消化：①PBS（37℃）润洗3次。②无酶消化液3 mL，消化9 min（等待期间准备好孵育用离心管；确认离心机参数为：120 rcf，1 min，25 ℃），吹打细胞使其从培养瓶表面脱落。直接转移至15mL离心管中，吹打混匀约20次（吹散细胞团，分离成单个细胞）。③显微镜观察确认细胞均从培养瓶上脱落，加入2-3 mL ECM至培养瓶中润洗，然后转移至上述离心管中，吹打终止消化。④离心：120 rcf，1 min，25℃。（等待期间各加入250 L待测文库至低吸附离心管中,注意要快速，吸取之前需要先混悬文库）。⑤离心之后小心倒出，用枪吸出剩下的ECM，加入2V L BB，重悬吸打混匀，获得5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL的细胞悬液。[align=left][font='times new roman'][size=16px]2.1.4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞与文库结合[/size][/font][/align]①孵育：分别加入250 μL上述细胞悬液至250 μL ssDNA文库中，进行孵育：4℃，30 min，打开摇床第二格。②等待期间离心机调至4℃；用密封袋装好洁净的1000 L枪头准备流式上样用；2.2.2.5 润洗重悬细胞①取出孵育好的体系，进行离心：4℃，120 g，1 min（等待期间准备好4℃ PBS)。②倒掉上清液，用枪头小心吸出管口残留的上清液，每管加500 L PBS（4℃）用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url]吸打重悬约20次。③再次离心4℃，120 g，1 min。④第二次重悬：重复①-③步骤。⑤每管加入500 L PBS重悬，忽略实验损失，最后得到理论细胞浓度为2.5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL的细胞悬液。[font='times new roman'][size=16px]2.2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]送样分析[/size][/font]FAM荧光染色较弱，在预处理之后应尽快进行流式分析，流式分析上样程序复杂，需要正确进行开机，测样，关机的步骤，才能够得到准确的数据。[align=left]（1）准备工作：[/align][align=left]准备1000 mL[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url]，1000 mL 洁净枪头，流式管，质控微球。[/align][align=left]①开启液流系统：由上至下打开流式细胞仪开关；再开启计算机，打开FACSDiva软件，在“Cytometer仪器框”中确认流式细胞仪已与电脑连接，启动液流之前，确认液流系统水平，进行补充鞘液、去离子水、乙醇以及漂水，并清空废液。[/align][align=left]在“Cytometer”菜单中，点击“Fluidics Startup（启动液流系统）”，按照提示进行操作：确定气路和液路是从乙醇桶连接到了鞘液桶上：将蓝色液路管接到过滤器下方，透明气路管接到鞘液桶上；确定闭合的喷嘴是在流动检测池上。[/align][align=left]②将70 m的喷嘴放入装有超纯水的烧杯中，超声30 s，用无尘纸蘸干；抽出闭合的喷嘴；插入70 m的喷嘴（红圈朝上）。[/align][align=left]③点击“×steam”，开启液流，出现水滴状，调整使上端横线位于第二个或者第三个水滴的尾部，下端横线位于第三个或者第四个液滴的中部，调整好后关闭液流。[/align][align=left]（2）做质控：[/align][align=left]①用CS&T微球，用之前一定将微球甩匀（保证取出的微球呈均匀体系）用涡旋震荡；取一支洁净的流式管加入333 L的鞘液，再加一滴微球（用之前用混悬仪混匀，正常的微球为浑浊状）。[/align][align=left]②打开液流系统，在“Cytometer”菜单下点击“CST”；展开Setup Control窗口：在Characterize菜单中中选择“Check Performence”；在Configuration流式设置中：喷嘴的大小：选择70m，点击左下角“set configuration”，再点击“OK”。[/align][align=left]③选择微球的Lot ID：与微球瓶身上编号对应：10549。[/align][align=left]④敲弹准备好的微球悬液使其混匀，进行上样，打开液流；确认激发光源没问题即可关掉页面并关掉液流。[/align][align=left]（3）上样：[/align][align=left]①新建样品，并勾选FITC、SSC、FSC的H、A、W、log数据项。[/align][align=left]②作图：建立散点图，横坐标为FSC-H，纵坐标为SSC-H；再建立一个图：横坐标：FITC-H，纵坐标为：Count。[/align][align=left]③打开液流至3，选择对应样品；吹打混匀并放置样品，点击“LOAD”上样。调整FSC和SSC的电压，使散点图的中的点都集中在所圈的门中。（若散点偏右，则FSC电压过大，调整FSC电压使其变小，若散点偏上，则调整SSC使其变小。）当调整合适时点击“RECORD”记录数据。[/align][align=left]④计数完毕，调低流速，点击“unload”，选择第二个样品并重复第③步。[/align][align=left]⑤上样完毕之后，保存数据。[/align][align=left]（4）关机步骤：[/align][align=left]①上一管clean液，高速冲2 min；再上一管去离子水，高速冲5 min；关闭液流，检查液路系统。[/align][align=left]②在“Cytometer”菜单中，选择“shutdown”，根据指示操作：取下70 m的喷嘴，超声清洗，安装闭合喷嘴（红色点朝上）。[/align][align=left]③把液路和气路连接到乙醇桶上，用乙醇冲洗（先拔气路再拔液路）。[/align][align=left]④装一管clean液，清洗上样针和流动池。[/align][align=left]完成上述步骤之后即可关闭界面。[/align][align=left][/align][font='times new roman'][size=16px]2.3数据处理：[/size][/font]将原始数据用Flowjo软件进行处理，得到散点图以及荧光强度直方图，接下来通过举例来说明数据如何分析：（1） 散点图分析：[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111301026242555_5228_5413603_3.jpeg[/img][size=13px]数据处理分析散点图[/size][/align]该图为散点图，可以看出大体分为两个集团，散点图有两个集团说明体系中有两种细胞粒子，并且在该图片的左下角粒子较少，说明细胞碎片较少，在预处理时较好地保护了细胞的完整性。散点图中可以区分出整个上样的体系中主要含有两种大小的细胞颗粒，在预处理的过程中，无酶消化液的消化能力较弱，并且细胞团密度较大，细胞间黏连较多，在最后孵育结束用PBS进行重悬的时候仍然能够肉眼可见有白色细微絮状物。FSC值越大，代表颗粒的体积越大；SSC值越大，代表颗粒内部的复杂程度越高。故可初步判断，G1门中的颗粒为未消化完全的细胞团，而G2门中的颗粒为分散的单个细胞。（2） 直方图分析：[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111301026243736_5071_5413603_3.jpeg[/img][size=13px]数据处理分析直方图[/size][/align]图中为G2门选中的样品的荧光强度，该图中有两个峰，横坐标10[font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font]附近所产生的荧光峰可以判定是残留的细胞碎片，可视为背景值，横坐标10[font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font]~10[font='times new roman'][size=16px]5[/size][/font]附近的峰代表四个适配体分别与细胞结合所产生的荧光强度，SYL3C-Aptamer结合偏移量最大，荧光较强，且高荧光事件次数较多，说明SYL3C-Aptamer与单个细胞的结合能力最强，并且G2门中的颗粒大多数为消化完全的单个细胞，呈现出较好的特异性。总之，该组结果对比体现出，单个细胞靶点较多，适配体与单个细胞结合能力较高，通过荧光强度波峰的偏移所反映的适配体与细胞特异性结合能力的大小依次为SYL3C-Aptamer＞EP166-Aptamer＞CA2-Aptamer＞ARC1172-Aptamer。同时，由图中可以看出：10th-ssDNA pool与SYL3C-Aptamer在10[font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font]～10[font='times new roman'][size=16px]5[/size][/font]荧光强度波峰较高，说明二者与单个细胞的结合能力较好，结合位点较多，呈现良好的特异性和亲和性。SYL3-Aptamer荧光波峰明显右移，与单个细胞的结合位点较多。[font='times new roman'][size=16px]三、总结[/size][/font]本次说明旨在利用带荧光的适配体靶向特异性结合目的细胞的原理，利用流式细胞仪监测适配体结合靶细胞能力的强弱，同时还可以应用于不同适配体靶向同一种细胞的结合能力强弱的比较。进一步利用流式细胞仪，还可以测定适配体的Kd值；还可以根据预处理的条件不同，与对照组比较，来测定适配体靶向细胞的受体是位于细胞膜表面还是细胞内，从而进一步测定适配体的生物学稳定性。同时，流式细胞仪还有很多方面的应用，例如鉴定细菌、检测细胞凋亡等，一些抗体-细胞复合物的结合情况也能够由流式细胞仪来进行监测。 在进行流式上样的过程中，预处理、上样以及数据处理阶段都有需要注意的细节，例如：本次所使用的细胞为贴壁生长的内皮细胞，故在细胞预处理时需要先消化细胞；在进行上样前，需要将样品进行吸打混匀，以免细胞沉积在流式管底部，导致未吸取到样品；在应用流式细胞仪的过程中，使用前的维护、质控流程十分重要，该流程会直接影响所得数据的稳定性；不同的流式细胞仪的维护程序稍有不同，本次说明中的使用方法只适用于BD FACSAria III，流式细胞仪具有强大的分析功能，其在细胞研究中具有重要的作用。[align=left][/align][align=left][/align][align=left][/align][align=left][/align]

4.1 流式细胞仪基本原理1. 生物学颗粒分析原理① 流式细胞技术是在单细胞水平上，对于处在快速直线流动状态中的大量细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术，现已成为现代医学研究最先进的分析技术之一。应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞术。② 生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等，所检测的生物颗粒的理化性质包括细胞大小、细胞形态、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白质含量、细胞膜完整性和酶活性等。③ 流式细胞仪是以激光为光源，集流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。 ④ 流式细胞仪是在荧光显微镜技术、血细胞计数仪和喷墨技术的基础上发展起来的。⑤ 鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，与水平方向的激光束垂直相交，染色的细胞受激光照射后发出荧光，这些信号分别被光电倍增管荧光检测器和光电二极管散射光检测器接收，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得到细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。2. 流式细胞仪细胞分选原理在压电晶体上加上频率为30kHz的信号，使液柱断裂成一连串均匀的液滴。当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内，从而达到细胞分类收集的目的。4.2 流式细胞仪的分类和基本结构1. 流式细胞仪的分类流式细胞仪根据功能不同可分为临床型(亦称台式机)和科研型（亦称大型机）。流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。http://www.care100.com/yqxjpkc/images/112.gif

LASER是light amplification by stimulated emission ofradiation.的缩写。意为“受激发射的辐射光放大”。1964年按照我国著名科学家钱学森的建议将“光受激发射”改称“激光”。 本特利流式细胞仪中使用的氩离子激光器是一种固体激光器。这种激光器的特点是频率稳定性高，相干性好，寿命长。激光是这样产生的：当高压放电激发电子，电子吸收能量跃迁到高能级，然后在短时间内释放光子，回到基态。等离子管末端的光学系统来回反射光子。这些光子与其它受激电子相互作用，释放出更多与其波长、相位、方向相同的光子，随着光子数量的增加，光信号得到放大产生激光，并通过放电管尾部的布鲁斯特窗产生偏振，以最小损耗率传送。我们在等离子管周围加一磁场，对带电粒子起约束作用，以提高放电区中心的电子密度和离子密度，从而提高了输出功率。 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光(laser)是—种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞需要足够的光照强度。 激光光束在达到流动室前，先经过透镜将其聚焦，形成几何尺寸约为22μm×66μm，即短轴稍大于细胞直径的光斑。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致，须将样本流与激光束正交，且相交于激光能量分布峰值处。 激光光束在到达流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成短轴稍大于细胞直径的光斑。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞是一个一个分别受到光照并且受照强度十分一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处。光路调节通过仪器光学部分三个旋钮调节，对用户是相对封闭的，即安装时由工程师调试完毕后，不推荐用户作任何调节。

http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/201203/2012030911450761.jpg细胞S-腺苷甲硫氨酸成像图，随着每个时间点蛋氨酸（右下）的增加，荧光强度也增高通过基因工程技术使得细胞表达一种经修饰（改造）过的RNA，又称Spinach，研究人员能对活细胞中的小分子代谢物进行成像，并观察它们随时间变化是如何改变的。每个细胞新陈代谢都会产生代谢产物。假如能得知产物生成效率的话，就能辨识如癌症状态下细胞代谢的异常或确定药物能否将细胞的代谢状况恢复到正常状态。康奈尔大学威尔医学院的研究人员说发表在3月9日的《科学》杂志上的相关论文详细描述了这种先进的技术方法，这一技术将有可能彻底颠覆以往对代谢组学的认识，提供数千种细胞内代谢产物的动态变化的化学指纹图谱。威尔康乃尔医学院药理学副教授Samie R. Jaffrey博士说：“动态观察到代谢产物的变化将为我们提供新的和强大的武器，方便我们了解代谢在疾病状态下是如何改变的，并帮助我们找到可以将它们恢复到正常水平的方法”。Jaffrey博士领导威尔康乃尔的其他三名研究人员共同完成了这项研究。他说：“细胞的代谢水平调控着细胞诸多功能，也正因为如此，代谢水平的变化可以是细胞内在特定的时间内发生什么变化的写照”。例如生物学家都知道，肿瘤细胞存在代谢异常，这些细胞对葡萄糖能源的利用存在异常并产生独特的代谢产物如乳酸，从而有不一样的新陈代谢过程。Jaffrey博士说：“能够看到这些代谢异常的话，就可以了解癌症的发生发展。但是到现在为止，测量活细胞中代谢产物一直非常困难。Jaffrey博士和他的团队展开的科学研究表明：可以用特定的RNA序列来检测细胞中代谢产物的水平。这些RNAs是基于能在细胞发出绿色光的Spinach RNA设计的。Jaffrey博士研究小组修改Spinach的RNAs，使得它们一旦遇到它们专属绑定的代谢物时就关闭，造成Spinach荧光开启。他们设计出了RNA序列以追踪细胞中五个不同代谢产物包括二磷酸腺苷、细胞能量分子ATP和参与调节基因活性的甲基化过程的SAM（S-腺苷蛋氨酸）水平的变化。他说：“在此之前，一直没有人能够实时观察到细胞中代谢产物水平是如何变化的”。Jaffrey博士说：“在活细胞中运用RNA传感器，研究人员能够测量单个细胞中的目标代谢产物水平随着时间的变化而发生的改变，你可以看到这些代谢物如何响应信号刺激或遗传变化进而发生动态变化的。你可以筛选出能使得这些基因异常发生正常化的药物，我们的一个主要目标是确定药物是否能使细胞的新陈代谢正常化。新技术克服了现行的用绿色荧光蛋白（GFP）标记活细胞以充当传感器的缺点。如果将绿色荧光蛋白和其他发光蛋白质融合到能结合某种代谢物产物的自然存在的蛋白质中的话，绿色荧光蛋白和其他发光蛋白质就可以用来充当代谢感应器。但在某些情况下，代谢产物与自然存在的蛋白质结合方式会扭转蛋白质结构，进而影响已经融入到这些蛋白质中的荧光蛋白。另外，对于大多数的代谢产物，并没有可用来融合绿色荧光蛋白以制造传感器的蛋白质。通过使用RNA作为代谢物传感器，这个问题引刃而解了。Jaffrey博士说：“关于RNA令人惊奇的是，你可以得到基本上你想要结合任何一种小分子代谢物的RNA序列。他们可以在几个星期就能生产出来”。然后，这些人造序列融合到Spinach中，并在细胞中以单链RNA的形式表达。Jaffrey博士说：“这种做法能让你得到任何你想研究的小分子代谢物，以及这些小分子代谢物在细胞内的情况”，他和他的同事们将这一技术的运用范围扩大到能检测活细胞内的蛋白质和其他分子。他补充说道：该技术可应用于多种疾病研究中。Jaffrey博士说：“我们非常有兴趣研究导致发育障碍如自闭症的大脑神经细胞内的代谢如何是变化的，有很多的机会能让这一新的工具发挥用处”。这篇研究论文的合著者包括威尔康乃尔医学院药理系Jeremy S. Paige博士、Thinh Nguyen Duc博士、Wenjiao Song博士。这项研究由美国国立卫生研究院的生物医学成像和生物研究所以及McKnight基金会资助。康奈尔科技企业和商业中心（CCTEC）已经代表康奈尔大学提出了这项技术的专利保护申请。Samie Jaffrey博士是Lucerna技术的创始人和科学顾问，并持有该公司股权。此外，Lucerna技术拥有上述描述技术的相关许可证。