细胞学检测

生物发光技术在细胞学检测中的应用摘要：本文就生物发光技术的种类、机理、及其技术特点进行了综述，并就其在细胞学检测中的应用与研究进展展开了讨论。关键词：生物发光； ATP；荧光素酶；细胞凋亡；细胞内游离Ca2+自从20多年前，Marlene A DeLuca’s第一个成功的获得表达萤火虫荧光素酶基因(luc基因)的转基因烟草以来，生物发光(Bioluminescenc，BL)作为一个古老而又年轻的技术, 近年来得到了很大的发展和广泛的应用。而近几年来，随着分子生物学的进展以及一些新生物技术工具的出现，尤其在某些关键技术如生物传感器、基因序列分析、活体细胞ATP 测定]等方面取得了一些突破，使生物发光的应用进入了一个新时代，极大提高了生物发光的检测和快速应用，其应用范围更进一步扩大[1]。1 生物发光的种类和特点尽管自然界中的生物体普遍存在发光现象，它们的发光机理、强度和光谱范围存在着很大差异。目前，国际上根据发光的机理不同将生物发光分为：受激荧光，发光生物发光，化学发光和生物的超微弱发光[3,4]。1.1 受激荧光受激荧光是指生物体在受到外界光辐射的作用时，体内固有的荧光物质或吸收的荧光标记物发光的现象。在生物学领域中，由于分析物质荧光的方法敏感性极高，而且几乎所有的有机分子都能够直接或经过适当的化学处理后发生荧光，故很早就受到重视，并逐渐发展成为生物学和医学中的荧光分析。在生物医学领域应用荧光分析最多的是荧光显微技术，基本工具为荧光显微镜。但一般的荧光显微镜某些情况下荧光的亮度不足，使观察困难随着光电技术和计算机技术的进步，已经发展出的激光共聚焦显微镜，操作更加方便，实验可重复性提高，使受激荧光的应用更加广泛[5]。1.2 发光生物发光在生物发光领域中最容易被人们所接受的发光现象就是以萤火虫的闪光为代表的发光生物发光[3]。现在，已了解各种发光生物发光的基本反应，在这个领域中也取得了一些新的进展，例如在体外重组虫荧光素酶，用基因工程技术在大肠杆菌中表达；人工合成荧光素；体外模拟细菌发光体系已获成功；细菌的发光基因已被提出，同样也已用基因工程方法在大肠杆菌中表达。水母发光蛋白已经分离纯化，一级结构已经清楚。由于生物发光的量子效率极高，所以研究生物发光能量的转化具有重要的理论与实际意义。近年来被广泛应用的发光蛋白，如GFP、YFP、CFP 等，其发光原理就是源自动物的自发发光，从而为生物医学研究提供了新的手段[6]。1.3 化学发光化学发光是在化学反应过程中(主要为氧化还原反应)发出可见光的现象[6]。化学发光反应是由两个关键步骤组成：激发和发射。许多化学反应进行时能释放足够的自由能而把参加反应的物质之一激发到能发射光的电子激发态，生成一种激发态产物，在它回到基态时，剩余能量转变成光子能量产生发光现象。随着化学发光物质合成技术的进步，化学发光在生物医学及其它领域的应用越来越广泛[7,8]，将化学发光与免疫反应结合起来建立的化学发光免疫测定法和化学发光标记是继荧光标记，放射性核素标记，酶标记三大标记技术之后，发展起来的最新检测技术[8]。1.4 生物超微弱发光 随着生物发光研究的进一步深入，发现人体的器官、组织、细胞、乃至大分子都在发光，不过发光强度更弱。这些有关生物超微弱发光(ultra-weak bioluminescence)的研究课题，构成了当前生命科学发展前沿中的一个极其重要的研究领域——生命系统的超微弱光子辐射(ultra-weak photon emission from living system) [8]。20世纪60~70 年代以来，各国先后出现了一些研究小组专门进行这方面的探讨，如日本的稻场文男小组(1991)研究了鼠肝核的超微弱天然光子发射；德国F.A. Popp小组提出了“生物光子”概念和一系列的相干理论[9]。目前研究已涉及到细胞、亚细胞乃至生物大分子的层次[ 9,10]。越来越多的实验表明，DNA 是生物超微弱发光的一个辐射源。1.5 生物发光特点研究发现生物发光有以下几个特点：① 生物发光的颜色范围很宽，可从红光到深蓝光；② 氧是几乎所有生物发光系统中必须的因素；③ 生物发光是由“荧光素酶”与“荧光素”的化学反应所引起的；④ 所有的生物发光反应似乎都是酶-底物类型的反应，但复杂程度不同，某些生物发光反应涉及3 种或4种底物，而另一些生物发光反应甚至需要3个或4个酶的体系[8]。[/size]

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1677年荷兰Antonie van Leeuwenhoek （1632－1723）显微镜学家、微生物学，用简单显微镜观察到动物的“精虫”（细胞）。1665年英国Hooke Robert（1635-1703）博物学家提出细胞和细胞结构的概念。1827年贝尔发现哺乳类的卵子，对细胞本身进行认真的观察。1838年描施莱登述了细胞是在一种粘液状的母质中，经过一种像是结晶样的过程产生的，并且把植物看作细胞的共同体。在他的启发下施万坚信动、植物都是由细胞构成的，并指出二者在结构和生长中的一致性。1845年德国动物学家西博尔德（1804-1885）断定原生动物都是单细胞的。1852年德国病理学家菲尔肖（1821-1902）在研究结缔组织的基础上提出“一切细胞来自细胞”的名言，并且创立了细胞病理学。1867年德国植物学家霍夫迈斯特对植物，分别比较详细地叙述了间接分裂。1873年施奈德对动物，分别比较详细地叙述了间接分裂。1875年德国植物学家施特拉斯布格首先叙述了植物细胞中的着色物体，而且断定同种植物各自有一定数目的着色物体；1880年巴拉涅茨基描述了着色物体的螺旋状结构，翌年普菲茨纳发现了染色粒。1882年德国细胞学家弗勒明在发现了染色体的纵分裂之后提出了有丝分裂这一名称以代替间接分裂。施特拉斯布格把有丝分裂划分为直到现在还通用的前期、中期、后期、末期；他和其他学者还在植物中观察到减数分裂，经过进一步研究终于区别出单倍体和双倍体染色体数目。1882年捷克动物生理学家浦肯野提出原生质的概念。1888年瓦尔代尔才把核中的着色物体正式命名为染色体。1891年德国学者亨金在昆虫 的精细胞中观察到 X染色体。1902年史蒂文斯、威尔逊等发观了 Y染色体。1900年重新发现孟德尔的研究成就后，遗传学研究有力地推动了细胞学的进展美国遗传学家和胚胎学家摩尔根（1866—1945）研究果蝇 的遗传，发现偶尔出现的白眼个体总是雄性；结合已有的、关于性染色体的知识，解释了白眼雄性的出现，开始从细胞解释遗传现象，遗传因子可能位于染色体上。细胞学和遗传学联系起来，从遗传学得到定量的和生理的概念，从细胞学得到定性的、物质的和叙述的概念，逐步产生出细胞遗传学。此外，发现了辐射现象、温度能够引起果蝇突变之后，因突变的频率很高更有利于染色体的实验研究。辐射之后引起的各种突变，包括基因的移位、倒位及缺失等都司在染色体中找到依据。利用突变型与野生型杂交，并且对其后代进行统计处理可以推算出染色体的基因排列图。广泛开展的性染色体形态的研究，也为雌雄性别的决定找到细胞学的基础。20世纪40年代后，电子显微镜得到广泛使用，标本的包埋、切片一套技术逐渐完善，才有了很大改变。开始逐渐开展了从生化方面研究细胞各部分的功能的工作，产生了生化细胞学。