质谱基因芯片高通量分析仪

仪器信息网讯 2011年3月7日至14日，博奥生物有限公司的晶芯® ArrayCompassTM基因芯片分析系统、晶芯® LuxScanTMDx/HT24高通量微阵列芯片扫描仪、晶芯® ExtractorTM36 核酸快速提取仪及博奥生物晶芯® 医学产品亮相国家“十一五”重大科技成就展。 晶芯® ArrayCompassTM基因芯片分析系统 　　该产品是博奥生物有限公司与Affymetrix公司经过3年的合作，共同推出的基于PEG Strip芯片(原位合成技术)的超高密度微阵列芯片反应与检测一体化系统，可用于高密度、中低通量的表达谱芯片、重测序芯片的分析，为进行此类研究的用户提供了一个高性价比的技术平台。其工业造型更是在2010年获得了具有工业设计“奥斯卡”之称的德国“红点奖”。 晶芯® LuxScanTMDx/HT24高通量微阵列芯片扫描仪 　　晶芯® LuxScanTMDx/24高通量微阵列芯片扫描仪是一款具有高通量、高自动化、高灵敏度和高分辨率的芯片扫描仪，可应用于临床检验、食品安全检测和生命科学研究等多个领域。此产品在晶芯® LuxScanTM10K微阵列芯片扫描仪优质性能基础上，提高了产品自动化和扫描通量，进一步提高了产品的性价比。 晶芯® ExtractorTM36 核酸快速提取仪 　　晶芯® ExtractorTM36核酸快速提取仪适用于批量快速核酸提取，可方便快速地一次性提取36份细菌核酸样品。与配套的晶芯® 核酸快速提取试剂盒一起使用，可使核酸提取操作稳定可靠、简单快捷。简单两步操作即可完成核酸提取，操作时间在10min左右。 博奥生物晶芯® 医学产品 　　左为晶芯® 九项遗传性耳聋基因检测试剂盒(微阵列芯片法)，右为晶芯® 分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(DNA微阵列芯片法)。 　　关于博奥生物有限公司： 　　博奥生物有限公司暨生物芯片北京国家工程研究中心成立于2000年9月30日，注册资金现为3.765亿元人民币。目前，公司拥有数十项具有自主知识产权，已研制开发出生物芯片(包括基因、蛋白、细胞芯片和芯片实验室等)及相关仪器设备、试剂耗材、软件数据库等四个系列的产品，可以为广大客户和合作伙伴提供先进的高通量生物芯片技术服务和行业应用整体解决方案。

注：最新的测序技术会实现全自动化、实时化、微型化，虽然与传统的芯片技术并不相同，但其理念有共通之处，所以也将其纳入&ldquo 芯片&rdquo 范畴。&mdash &mdash 彭雷 　　80年代中期，俄罗斯科学院恩格尔哈得分子生物学研究所和美国阿贡国家实验室(ANL)的科学家们最早在文献中提出了用杂交法测定核酸序列(SBH)新技术的想法。当时用的是多聚寡核酸探针。几乎与此同时英国牛津大学生化系的Sourthern等也取得了在载体固定寡核苷酸及杂交法测序的国际专利。 　　基因芯片利用微电子、微机械、生物化学、分子生物学、新型材料、计算机和统计学等多学科的先进技术,实现了在生命科学研究中样品处理、检测和分析过程的连续化、集成化和微型化。 　　1997年世界上第一张全基因组芯片&mdash &mdash 含有6166个基因的酵母全基因组芯片在斯坦福大学Brown实验室完成，从而使基因芯片技术在世界上迅速得到应用。 　　基因芯片技术主要包括四个基本要点：芯片方阵的构建、样品的制备、核酸分子反应和信号的检测。1、芯片制备，先将玻璃片或硅片进行表面处理，然后使核酸片段按顺序排列在芯片上。2、样品制备，可将样品进行生物处理，获取其中的DNA、RNA，并且加以标记，以提高检测的灵敏度。3、生物分子反应，芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使样品中的核酸分子与芯片上的核酸分子反应处于最佳状况中，减少错配比率。4、芯片信号检测，常用的芯片信号检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中，通过扫描以获得有关生物信息。 　　基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统(micro total analytical system)或称缩微芯片实验室(laboratory on a chip)。使用缩微芯片实验室，就可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。 　　近年,基因芯片技术在疾病易感基因发现、疾病分子水平诊断、基因功能确认、多靶位同步超高通量药物筛选以及病原体检测等医学与生物学领域得到广泛应用。 　　一、第一代基因芯片 　　第一代基因芯片基片可用材料有玻片、硅片、瓷片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜和尼龙膜,其中以玻片最为常用。为保证探针稳定固定于载体表面,需要对载体表面进行多聚赖氨酸修饰、醛基修饰、氨基修饰、巯基修饰、琼脂糖包被或丙烯酰胺硅烷化,使载体形成具有生物特异性的亲和表面。最后将制备好的探针固定到活化基片上,目前有两种方法:原位合成和合成后微点样。根据芯片所使用的标记物不同,相应信号检测方法有放射性核素法、生物素法和荧光染料法,在以玻片为载体的芯片上目前普遍采用荧光法。 　　相应荧光检测装置有激光共聚焦显微镜、电荷偶合器( charge coup led devices, CCD)、激光扫描荧光显微镜和激光共聚焦扫描仪等。其中的激光共聚焦扫描仪已发展为基因芯片的配套检测系统。经过芯片扫描提取杂交信号之后,在数据分析之前,首先要扣除背景信号,进行数据检查、标化和校正,消除不同实验系统的误差。 　　对于简单的检测或科学实验,因所需分析基因数量少,故直接观察即可得出结论。若涉及大量基因尤其是进行表达谱分析时,就需要借助专门的分析软件,运用统计学和生物信息学知识进行深入、系统的分析,如主成分分析、分层聚类分析、判别分析和调控网络分析等。 　　芯片数据分析结束并不表示芯片实验的完成,由于基因芯片获取的信息量大,要对呈数量级增长的实验数据进行有效管理,需要建立起通行的数据储存和交流平台,将各实验室获得的实验结果集中起来形成共享的基因芯片数据库,以便于数据的交流及结果的评估。 　　典型如SuperArray公司的功能分类基因芯片： 　　1、引物设计 　　SYBR Green可与所有的双链DNA反应(包括引物二聚体)，为了使扩增反应集中于目的基因，避免非特异性扩增，引物设计成为关键因素。为得到单一特异的扩增产物，避免扩增出序列相似的非特异性产物，采用BLAST或者其他比对方法，检测引物在相应物种(如人，小鼠或大鼠)全基因组中的特异性。为了保证在相同的PCR条件下(特别是统一的退火温度)，不同基因均能扩增出相应的特异性产物，对引物的CG值，解链温度(Tm)，以及其他化学和物理的特性都进行了优化调整。为了获得高扩增效率，对扩增片段的长度也进行了优化，一般为100到200bp，确保在统一的循环反应的时间范围内，不同基因均能扩增出完整片段。 　　2、反应体系 　　为避免非特异性扩增，使用化学修饰的热启动Taq酶，只有经过热激步骤，Taq酶才能发挥扩增活性。同时，反应体系经过优化，可最大限度减少引物二聚体形成，并且保证较难扩增的片段都得到极高的扩增效率。 　　3、定量结果可靠 　　在标准的96孔PCR反应仪中进行实时定量PCR实验，为了获得高通量，无法为每个样品单独制备标准曲线。在完全相同的PCR反应条件下，希望表达量不同的多个基因均获得可靠的结果，需要确保每个基因都有较高的扩增效率，从而可采用简单的△△Ct方法计算基因表达量。 　　其灵敏度高，样品的使用量低，每张芯片使用的总RNA最少可为0.5ng 可观察到的动态线性范围超过105，可以同时检测表达量差异较大的基因 Ct值的平均差异只有0.25个循环，可检测超过两倍的基因表达量变化。因此，第二代功能分类基因芯片是研究特定信号通路或者一组功能相关基因表达量的理想方法。 　　二、第二代基因芯片 　　尽管基因芯片技术已经取得了长足的发展，但仍然存在着许多难题和不足。目标分子的标记是重要的限速步骤，如何绕过这一步是人们一直期望解决的问题。其次是检测灵敏度不高，重复性差，无法检测单碱基错配的基因样品。再者，待检测的基因样品必须经过PCR扩增技术的处理以获得足够量的待检测样品，使检测过程相对复杂。我们称具备以上特征的基因芯片技术为第一代基因芯片技术，这些特征充分说明基因芯片技术本身存在着较大的发展空间。 　　第二代基因芯片包括如下几种： 　　1. 电极阵列型基因芯片：将微电极在衬底上排成阵列，通过对氧化还原指示剂的电流信号的检测实现基因序列的识别 　　2. 非标记荧光指示基因芯片：利用荧光分子作为杂交指示剂，在不需对靶基因进行荧光标记的前提下，通过对荧光分子的检测实现基因序列的识别 　　3. 量子点指示基因芯片：利用量子点作为杂交指示剂，在不需对靶基因进行荧光标记的前提下，通过对量子点的扫描实现基因序列的识别 　　4. 分子灯塔型基因芯片：利用探针DNA片断的发夹结构，获得单碱基突变检测的能力。 　　三、第三代基因芯片 　　目前，众多的第三代基因芯片现在也推向了市场。第三代基因芯片代表了测序的最高水平和未来走向。 　　1、Illumina微珠基因芯片技术 　　这是Illumina公司核心技术之一，博奥生物基于Illumina微珠芯片平台，推出SNP分型检测服务以及定制SNP分型检测服务。 　　它首先用微机电技术在光纤末端或硅片基质上蚀刻出微孔(深度约为3毫米的相同凹槽)，将&ldquo 微珠池&ldquo 内的微珠&ldquo 倒&rdquo 入光纤束微孔，每个微孔恰可容纳一个微珠，在范德华力和与微孔壁间流体静力学相互作用下，微珠以&ldquo 无序自组装&rdquo 的方式在微孔内组装成芯片。每种类型的微珠平均有 30 倍左右的重复。 　　每一个微珠上都偶联有80万左右拷贝数的探针。每一个探针由特异的地址序列(对每种微珠进行解码，29mer)和特异序列(代表不同的检测信息，如SNP 位点序列、基因序列等)组成。用专利的解码技术对芯片上的微珠进行解码，完成对芯片微珠定位信息的收集和确认，也实现芯片生产过程中100%质控。 　　以四种荧光标记进行16种微珠解码为例，解码过程使用与地址序列互补的且分别标记4种荧光染料的探针进行。把标记4种荧光的不同地址序列探针进行组合，每次杂交后探针清洗下来进行下一轮杂交，通过多轮杂交达到指数型区分能力。 　　2、Ion Torrent半导体基因芯片 　　Ion Torrent半导体基因芯片是最新一代的测序技术，它的问世给测序技术的应用带来了激动人心的进展。它采用了半导体技术和简单的化学试剂进行DNA测序，而不是使用光作为媒介。在半导体芯片的微孔中固定DNA链，随后依次掺入ATCG。随着每个碱基的掺入，释放出氢离子，在它们穿过每个孔底部时能被检测到，通过对H+的检测，实时判读碱基。 　　Ion Torrent个人化操作基因组测序仪(PGMTM)是第一台基于半导体技术的测序仪。与其他测序技术相比，使用该项技术的测序系统更简单、更快速、及更易升级。该测序仪与其他高通量测序仪特征互补，可以迅速完成应急服务项目，缩短服务周期，增加服务效率。 　　3、实时单分子测序基因芯片 　　太平洋生物科学公司(PacBio)实时单分子测序基因芯片是直接测由DNA聚合酶将荧光标记的核苷酸掺入互补测序模板。该技术的核心是一个零点启动模式的波导(Zero-mode Wavelength，ZMW)纳米结构的密集排列， 这一排列阵可以进行单个荧光分子的光学审视。 　　在过去，零点启动模式波导结构被用于从大量高密度的分子中分辨出单一的荧光分子，还没有被用于大量平行分析的操作。为使之用于大量平行分析和数据输出通量(测序数据生成能力)，太平洋生物科学公司开发出一种方法，能有效地将零点启动模式波导结构排到表面上，他们采用了电子束光刻技术(Electron beam Lithography)和紫外光电子束光刻技术(Ultraviolet Photo lithography) 以及高度平行的共焦成像系统， 这样可以对零点启动模式纳米结构中的荧光标记分子进行高灵敏度和高分辨率的探测，并采用了一个沉重的稳定平台来确保良好的光学聚焦效果。 　　4、纳米球基因芯片 　　全基因组学公司(Complete Genomics)的纳米球基因芯片是以杂交和连接反应为核心的。当通过杂交和连接进行测序的方法出现以后，全基因组学公司推出了新的样品处理方法和纳米阵列平台。基因组DNA首先经过超声处理，再加上一些接头，然后模板环化，酶切。最后产生大约400个碱基的环化的测序片段，每个片段内含有4个明确的接头位点。环化片段用&Phi 29聚合酶扩增2个数量级。一个环化片段所产生的扩增产物称为DNA纳米球(DAN nanoball, DNB)。纳米球被选择性地连接到六甲基二硅氮烷处理的硅芯片上。 　　5、纳米孔基因芯片技术 　　另外，还在发展中的纳米孔基因芯片技术是很有潜力的第四代技术。因为这种方法不再需要光学检测和同步的试剂洗脱过程了。 　　这是一种基于纳米孔(纳米洞)结构的完全不同的测序技术，单个碱基的读取可以靠测定经由纳米级别的孔洞而跨越或透过薄膜的电导率来进行。纳米孔技术可以广泛地归纳为两类：生物类和固态类。 　　&alpha 溶血素是一种能天然性地连接到细胞膜中继而导致细胞溶解的蛋白质，它第一个被用来做成生物纳米孔模型。第二类纳米孔是以硅及其衍生物进行机械制造而成。 使用这些合成的纳米孔可以降低在膜稳定性和蛋白定位等方面的麻烦，而这些正是牛津纳米孔公司所创立的生物纳米孔系统一直遇到的问题。 　　例如，Nabsys就发明了一套系统，他们以汇聚的离子束将硅片薄膜打成纳米孔，用于检测与特异性引物进行了杂交的单链DNA穿过纳米孔时的阻断电流变化。 IBM创建了一个更为复杂的系统，能有效地使DNA位移暂停，并在暂停的时候通过隧道电流检测识别每个碱基。 　　四、基因芯片市场分析 　　1、国外市场美国illumina公司一家独大 　　在SNP芯片研究领域，美国illumina公司毫无疑问是霸主，illumina公司凭借自己开发的GoldenGate技术和infinium专利技术一直在SNP芯片领域处于垄断地位。 　　illumina的全基因组表达谱芯片是目前唯一一种可以达到探针30倍重复的表达谱芯片，其他的芯片都只能达到1-8倍技术重复。因此illumina的全基因组表达谱芯片的重复性是所有芯片中最高的，其重复性R20.996，并且基于第三代基因芯片独特的微珠芯片生产工艺，芯片生产成本较低，信噪比和灵敏度都非常高，其灵敏度&le 1:250,000，芯片检测结果和qPCR相关系数R2=0.97。 　　因为illumina所占的市场份额越来越多，2012年6月另一基因芯片大厂家Nimblegen公司，正式宣布退出基因芯片市场。 　　2、国内市场刚刚起步 　　国内基因芯片制造水平低，相关的企业规模小、投入也少，远达不到国外的水平。所以国内的相关公司均以引进国外基因芯片，提供检测服务为主。不过，随着基因芯片的应用推广，一些公司也开始涉足基因芯片制造。 　　上市公司达安基因，业务以体外诊断为主，产品主要是试剂盒，但也开始涉足基因芯片制造。达安基因2013年申报的三个专利：一种用于基因检测的电路板 ZL201320244125.X 一种电化学基因芯片 ZL201320244116.0 一种基于基因芯片的检测装置 ZL201320244734.5。 　　而另一以基因检测服务著称的大企业华大基因，则通过收购国外公司进入基因芯片制造领域。美国上市公司Complete Genomics 公司有自己基因芯片和芯片检测设备。但该公司2011年的业绩只有2000多万美元，其基因测序服务成长大大低于预期，股票跌破发行价，最后被中国华大基因收购。 　　联川生物在microRNA芯片领域也小有名气，也是唯一一家国产的microRNA芯片，该芯片最大的特点就是更新速度极快，一般新的数据库发表后，第一个将芯片更新到最新版本的就是联川生物。illumina公司于2010年退出了microRNA芯片市场，因illumina公司2006年收购了高通量测序领域NO.1的Solexa公司，成为唯一一家即拥有芯片平台又拥有高通量测序平台的供应商，illumina认为在microRNA领域，高通量测序有不可比拟的技术优势，必然会取代芯片，所以于2010年停产了microRNA芯片。

复杂的医学诊断可以再快些、精准些、费用再低些吗?基因芯片的出现及广泛应用或将解决这个问题。 　　去年11月，昆明寰基生物芯片开发有限公司基因芯片医学检测中心在云南国家级经济技术开发区海归创业园落成。这是我省首个专业基因芯片医学检测中心，也是国内唯一以基因芯片技术为核心的第三方医学检验机构，设计检测规模达到每年70万份临床标本。这是继去年云南省第一人民医院临床基础医学研究所“基因芯片诊断技术”获卫生部临床应用能力资格认证后，我省第二家计划利用基因芯片进行疾病诊断的机构。 　　和普通医疗诊断技术相比，基因芯片诊疗技术究竟高明在哪里?它的出现及推广应用对老百姓来说又意味着什么?带着问题，记者走访了昆明寰基生物芯片开发有限公司。 　　疾病检测 　　新技术带来的新革命 　　虽说生物芯片早在20世纪末就成功问世，并应用于药物筛选和实验室研究，但普通人对它还是知之甚少。基因芯片，又被称为DNA芯片或DNA微阵列，是DNA分子杂交技术与基因扩增标记等技术相结合的结晶。简单的说，基因芯片就是在一块特制玻璃片或其他支撑介质上有序的固定许多生物分子探针，然后由一种仪器收集探针捕获的待测样本信号，用计算机分析数据结果。也就是说，原来要在很多个试管中发生的反应，现在被移至一张芯片上同时完成了。和传统的医学检测手段相比，基因芯片的优点也就由此体现。据公司负责人介绍，基因芯片技术具有高通量、高灵敏性和特异性等基本特征，在感染性疾病、遗传性疾病、重症传染病和恶性肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势。因此，基因芯片临床检测试剂盒就具有了检测准确率高、快速且比较稳定等特点。 　　据介绍，生物芯片的研究始于20世纪80年代中期，自从1996年美国Affymetrix公司成功地制作出世界上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯片，并开发出了配套的芯片检测系统，此后世界各国在芯片研究方面快速前进，不断有新的突破。中国是世界上较早批准生物芯片进入临床应用的国家之一，到目前为止，国内已有多款基因芯片产品获得不同形式的医疗器械证书。 　　临床应用 　　产业化制约的慢发展 　　进医院，病人最焦虑的莫过于检查或等待检测结果。正常情况下，一项普通检查需时30分钟至1个小时，一项复杂检查结果则需等待一周或半月。而生物芯片呢?因为它对样品的需要量非常少，且一次检测能够对多种病原体感染情况作出判断，因此患者不必多次重复检测 同时，由于基因芯片检测主要是依靠先进的激光扫描读取信号，计算机分析检测结果，整个检测过程仅需花时5小时，大大减少了患者的等待时间。正因如此，其临床应用将以实现节约医疗资源支出、提高临床诊疗水平的目的。 　　2010年，云南省第一人民医院临床基础医学研究所“基因芯片诊断 　　术”获卫生部临床应用能力资格认证，成为当时国内第二家、云南省唯一具备“基因芯片诊断技术”临床应用能力的机构。这既标志着基因芯片检测技术能在有效地质量保证体系和监督管理机制下，服务于临床，为遗传病诊断、感染性疾病诊断、个性化治疗方案制定等提供快速、准确的辅助诊疗。也意味着基因芯片从技术到产品再到临床，有着极艰难的推广应用之路。在昆明寰基，记者了解到，虽然基因芯片因其在疾病诊断方面独有的特性，被专家誉为行业的终极产品。但由于一是目前许多传统的检测手段已运用较为成熟，二是基因芯片因产业化进程缓慢难以形成规模导致单价过高。那基因芯片何时才能真正造福于普通人的疾病诊断呢? 　　合力推进 　　新思路拓宽的新天地 　　据统计，目前我国生物芯片企业不少于50家，但获得国家有关部门认证的只有极少数。目前，70%—80%的生物芯片还只是用于科学研究领域，离完全产业化还有一段不短的距离。由于研发成本高，其产品价格也较高。 　　尽管生物芯片的未来发展之路不平坦，但是有关专家在展望生物芯片的前景时却认为，生物芯片在基因表达谱分析、基因诊断、药物筛选及序列分析等诸多领域已呈现出广阔的应用前景。昆明寰基生物芯片开发有限公司总经理滕仕喜认为，一个基于第三方的医学检测服务体系或将实现造福百姓这一目的。作为国内较早从事生物芯片开发的科技公司，昆明寰基从零起步，在省市两级科技项目经费支撑下，与省内相关科研单位合作，于2006年成功研发出了首个泌尿生殖系统基因检测芯片，到今年6月，公司将推出系列基因检测芯片新产品，并将逐步应用于临床检测。去年1月，公司在经开区投资兴建了基因芯片检测中心和基因芯片生产基地，已成功形成从生物芯片技术理论研究到产品研发再到应用的完整产业链。作为参与国家药监局起草《生物芯片技术标准》的生物芯片研发生产企业，昆明寰基对基因芯片的平民化运用很有信心。 　　在滕仕喜的设想中，第三方的医学检测服务体系不仅可以最大限度地降低成本，还会最大可能地造福患者。因为具备自有技术支撑的第三方医学检测，服务范围较大医院而言拓宽了很多。通过在各地开设的检测取样点，它的服务触角可延伸至缺乏检测技术和手段的中小医院，既减少了检测费，综合检测费用只需原有的30%。又提高了检测效率及精确度。基于此理念，不久前刚刚成立的昆明寰基生物芯片开发有限公司基因芯片检测中心正在按这个思路开展工作。在不久的将来，患者或将普遍受益于这项新技术和新模式。