质谱流式细胞技术数据分析

2019年，上海交通大学丁显廷教授和林关宁教授团队联合在Genome Biology上发表了题为“A Comparison Framework and Guideline of Clustering Methods for Mass Cytometry Data”的文章。 该文章从准确性（precision）、一致性（coherence）和稳定性（stability）三个层面由浅入深地阐明了不同单细胞质谱流式技术（CyTOF）细胞族群分析方法的优劣及其适用场景。这是国际一线杂志第一次报道中国大陆学者在单细胞质谱流式技术数据标准化和分析方法学方面的工作。相比传统荧光标记的流式细胞术，CyTOF技术采用金属同位素标记抗体，避免了荧光重叠和自荧光消除的问题，可在单细胞水平同时测量数百万细胞中近百种蛋白质的表达量。这种同时获取高维度蛋白质的超强能力使得CyTOF技术在药物优化、疫苗开发和疾病标记发现方面具有重要的应用价值。然而，迄今为止CyTOF技术的数据标准化、样本和数据的质量控制、分析方法学，主要还是基于欧美学者提出的Accense，PhenoGraph和Xshift等分析方法。虽然这些分析方法已被广泛应用于不同的领域和临床研究，但是很多研究者对于采用哪个方法能更好地分析个体化的数据仍然存在疑惑。在这篇文章中，研究人员在三类异源（骨髓细胞、肌肉组织、结肠组织）6个单细胞组学的数据集上对目前经典的无监督和半监督细胞分群方法进行了基准分析和深度比较。在准确性（precision）分析上，根据四种内部评价指标（Accuracy，F-measure， NMI和ARI）讨论了不同方法对细胞进行分群的准确性；在一致性（coherence）分析上，利用三种外部评价指标（DB，CH和XB）探讨了细胞分群方法揭示细胞数据内部本质结构的能力；在稳定性（stability）分析方面，研究了随细胞采样数量变化，不同方法的准确性和识别出的细胞亚群数量的鲁棒性。此外，这篇文章还讨论了分群方法的分群分辨率，发现PhenoGraph和Xshifit能够识别出更细粒度的亚群（亚群数量偏多），而DEPECHE倾向于识别粗粒度的亚群（亚群数量偏少）。图1 CyTOF数据细胞分群方法的选择决策树综合上述框架的分析结果，这篇文章为单细胞质谱流式分析领域的研究者，特别是初学者以及没有生物信息学基础的研究者，提供了细胞分群方法的选择决策树。图2 聚类方法的稳定性分析上海交通大学生物医学工程学院个性化医学研究院是中国最早建立起单细胞质谱流式技术的单位之一，并已初步实现技术向临床应用的转化，先后利用单细胞痕量蛋白分析技术完成了寄生虫耐药、银屑病、结肠癌、肺结核方面的相关临床应用研究。刘晓博士、宋炜宸博士生是论文的第一作者。丁显廷教授和林关宁教授是论文的通讯作者。相关研究得到国际人类表型组计划、国家传染病重大专项、上海市高峰高原学科建设计划、国家自然科学基金等项目的支持。

质谱流式细胞术及其在精准医学中研究进展张浩1,2,3, 韩国军1,2,31北京大学跨学部生物医学工程系；2北京大学口腔医院；3 北京大学医学部医学技术研究院。质谱流式细胞术（Mass Cytometry）是近年来应用最为广泛的单细胞技术之一种。其将流式细胞技术与质谱分析技术结合在一起，用金属同位素代替荧光标记特异性抗体或探针，并利用质谱来定量同位素标签，可以在单细胞水平完成多种生物标志物的检测分析，包括核酸、蛋白质及其它小分子。其具有高通量、高灵敏度和高稳定性等优点，尤其适合于肿瘤、免疫、血液、药物和遗传学等学科的研究。当前新冠病毒COVID-19对人体免疫系统造成严重侵害，质谱流式技术能够更深入、全面的分析人体免疫系统的各种细胞亚型及其比例的变化，并预测临床病程的变化趋势，对于早期诊断、治疗与病理研究具有重要意义。 （一） 质谱流式细胞术发展历史图 1美国斯坦福大学医学院Garry Nolan 实验室中三台质谱流式仪器： CyTOF 1， CyTOF 2，CyTOF 3 （Helios）和BD公司荧光流式细胞仪LSR II。[1]质谱流式细胞术从最初的分析方法学概念到单细胞仪器装置、最终在基础生物学与临床医学中取得重要的应用，经过近二十年的发展历程。图1为2015年美国斯坦福大学医学院免疫学与微生物学系Garry Nolan教授实验室中三台不同型号CyTOF质谱流式仪与BD公司荧光流式细胞仪同时使用的照片。回顾质谱流式细胞术的发展历史，有三位重要的科学家作出了杰出的贡献。如图2中所示，首先2002年清华大学张新荣教授在学术期刊Analytical Chemistry中第一次提出元素标记策略用于电感耦合等离子体质谱的生物大分子检测的方法学研究[2]；2009年加拿大多伦多大学的Scott Tanner教授在学术期刊Analytical Chemistry中首次发布质谱流式细胞仪（Cytometry for Time of Flight，CyTOF）的研究工作[3]，并成立DVS Sciences公司将传统流式细胞术与电感耦合等离子体质谱相结合，推出了首台商用质谱流式分析仪器。2011年斯坦福大学Garry Nolan教授首次将质谱流式技术成功应用于临床血癌免疫性疾病的单细胞的表型与磷酸化蛋白信号通路研究[4]，开创了质谱流式医学应用的新篇章。2014年，DVS Sciences公司和质谱流式技术被美国Fluidigm公司收购，随后分别于与2015年和2017年陆续推出了Helios质谱流式系统和Hyperion组织成像系统以及700多种相关抗体和预设计标记试剂盒。目前为止，全球已经安装超过200台质谱流式细胞仪，中国拥有30台以上。并且，已经有50多个临床试验使用了质谱流式细胞术，这表明高通量、高灵敏、高稳定的质谱流式时代已经来临。图2 质谱流式细胞术三位主要奠基人：图A左一为清华大学张新荣教授；图A右一为加拿大多伦多大学Scott Tanner教授； 图B第一排右一为美国斯坦福大学Garry Nolan。（二） 质谱流式细胞术原理质谱流式细胞术主要工作原理是通过重金属同位素标记抗体或探针，然后识别细胞表面或内部信号，被标记的细胞以细胞悬液形式进入雾化器，随后样品在等离子体内发生汽化，产生离子云、离子在四级杆内根据质荷比进行筛选，然后在时间飞行器中通过已知强度的电场加速后到达检测器，而其到达检测器的飞行时间与离子质量有关。最后将原子质量谱的数据转换为细胞表面或内部的信号分子数据，并通过专业计算机分析软件对获得的数据进行降维处理分析，从而得到细胞外部表型和内部信号网络的数据结果。图3 质谱流式细胞术金属稳定同位素标记探针。包括标记单克隆抗体分子的稀土同位素；标记细胞编码的贵金属同位素；标记细胞周期的卤素[1]。北京大学韩国军教授首次建立了48种稳定同位素单克隆抗体统一标记策如图3所示，并定量分析了镧系、钇、铟、钯同位素间的CyTOF质谱干扰。系统性的建立了标准方法用于同位素标记抗体定量分析、抗体活性与选择性验证、以及抗体细胞染色浓度优化等，被多个国际质谱流式实验室作为同位素抗体标记标准手册使用。与传统流式技术相比，质谱流式细胞术主要有以下优势：① 前者使用荧光基团偶联抗体或分子，后者主要通过金属同位素进行标记，因为细胞中不含或很少含有这些金属同位素，因此背景信号较低，检测数据可靠性较高；② 传统荧光流式采用激光器和光电倍增管作为检测手段，最多可同时检测通道数不足20个，而质谱流式细胞术使用ICP-MS作为检测手段，不仅提高了检测通道数，可同时检测100个左右参数，而且避免了通道信号之间的串色干扰，无补偿或补偿非常小，使方案设计更加容易。③ 除可以在单细胞水平进行自身多参数分析以外，还可以检测分析一些金属治疗药物的分布及代谢情况，比如顺铂类化疗药物等。但质谱流式细胞术当前也存在一些问题，比如样本采集速度慢，每秒最多约1000个事件；测量不同样本之间需要程序清洁，导致每个样本平均测样时间延长；由于样本被气化，所以无法进行前向散射和侧向散射测量，也不能分选回收细胞进行后续实验等。（三）质谱流式细胞术的应用3.1 细胞表型鉴定与信号通路检测质谱流式细胞术非常适合对复杂的细胞表型进行深层次分析，可以区分在疾病发展过程中发挥不同作用的相似细胞，这对疾病的个体化治疗具有重要意义。Su等人通过对结直肠癌患者血液中的T细胞群进行质谱流式分析，展示了患者个体及不同患者之间 T 细胞亚群的表型多样性[5]。此外，Lelieveldt等用HSNE进行数据分析，在免疫细胞中发现了稀有细胞群[6]。分析细胞因子可以为研究免疫激活状态提供新的视角。Vendrame 等人利用 CyTOF评估细胞因子对自然杀伤 (NK) 细胞的影响，发现白介素 (IL)-12/IL-15/ IL-18刺激可显著增加NK细胞中γ干扰素 (IFN‐γ)的表达[7]。Doyle等对丙型肝炎病毒(HCV)感染患者的肝脏和外周血中的浆细胞样树突状细胞(pDCs)进行了研究，证明肝脏pDC具有多功能性，能够在慢性HCV感染期间产生大量的IFN-γ 和其他免疫调节因子[8]。随着检测细胞因子的报道不断增多，CyTOF将可能成为免疫细胞功能研究中不可或缺的工具。细胞受外界刺激后，细胞内信号网络会做出相应反应。使用靶向磷酸化蛋白的金属螯合抗体，CyTOF能够检测单个细胞内的信号通路。Shinko等人为临床血样提供了磷酸化信号蛋白染色的优化方案[9]。厦门大学周大旺教授团队应用 CyTOF质谱流式细胞仪发现了Hippo信号通路中转录共激活因子TAZ在调节 CD4+初始T细胞分化为Th17细胞和Treg细胞的过程中发挥着关键调控作用及其重要机理[10]。 3.2细胞周期鉴定、RNA和蛋白质的共同检测细胞周期改变是肿瘤进展、生物发育和免疫调节的重要方面。Behbehani 等人开发了一种新的CyTOF方法来描绘细胞周期阶段，分别使用IdU、磷酸化视网膜母细胞瘤抗体、细胞周期蛋白 B1抗体、细胞周期蛋白 A 抗体和磷酸化组蛋白H3抗体来标记S、G0、G1、G2、和 M 期细胞[11]。并利用这种细胞周期鉴定方法，研究展示了介导急性髓性白血病化疗敏感性的细胞周期差异[12]。为了能够在单细胞分辨率下同时检测 RNA 和蛋白质，Frei 等人开发了 RNA 邻近连接技术 (PLAYR)[13]。PLAYR包括杂交、连接、滚环扩增和检测四个阶段。针对目标RNA设计两个相邻区段的探针，与目标RNA结合后再与Backbone和Insert两个探针进行杂交，随后Backbone和Insert探针连接成一个环，做为后续滚环扩增的模板，与带有金属标签的探针杂交后就可以扩增并检测了。PLAYR的优势在于可以同时兼容蛋白检测，在实验过程中，可以先用抗体对胞内外蛋白进行标记，然后在用PLAYR流程对RNA进行原位标记和扩增。我们可以根据表面Marker对细胞进行亚群分析，深入研究每个亚群中信号通路、转录因子的激活及其相关基因的表达。并且利用PLAYR监测脂多糖刺激后PBMCs中8个细胞因子mRNA和18个蛋白表位的变化，揭示了每个细胞的功能能力与其蛋白标记物表达之间的相关性。3.3 质谱流式细胞术成像Geisen 等人使用 CyTOF 对组织样本进行成像以获得蛋白质空间组学[14]。他们提出的IMC （Imaging Mass Cytometry）技术使用分辨率为 1 μm 的激光光斑进行烧蚀、雾化、电离，并通过惰性气流传送到质谱检测器。IMC 被认为是具有里程碑意义的发展，因为它在亚细胞分辨率下将细胞间相互作用和的空间信息联系在一起，并能同时分析多达50种参数。自推出以来，IMC 正迅速被应用于各个研究领域。Damond 等人使用 IMC 对4例非糖尿病患者、4例首发1型糖尿病患者和4例长期1型糖尿病患者的胰岛进行研究，描述了人类1型糖尿病的进展，并发现在发病之前β胰岛素细胞表型已经发生改变[15]。另一类元素标记的单细胞成像技术是利用二次离子质谱SIMS（Secondary Imaging Mass Spectrometry），图4为北京大学韩国军教授利用NanoSIMS 50L质谱对Hela单细胞核中新生成的DNA与RNA的时空分析[16]。图4 基于二次离子质谱的高分辨Hela细胞核成像技术与人工智能机器学习数据分析。3.4 新冠肺炎检测及治疗 Silvin等人对COVID-19 患者外周血进行单细胞CyTOF及RNA测序，发现血浆内钙结合蛋白水平和非典型单核细胞减少可以鉴别严重的COVID-19患者[17]。Schrepping等人对全血和外周血单个核细胞进行RNA测序和单细胞蛋白质组学分析，揭示了SARS-CoV-2感染后免疫系统的反应[18]。而Rendeiro等人利用质谱流式细胞术进行空间成像，研究包括SARS-CoV-2 感染在内的人类急性肺损伤的细胞组成和空间结构。从而使我们能够从结构、免疫学和临床角度提出生物学上可解释的肺病理图谱，为理解COVID-19和一般的肺损伤病理学提供了重要的基础[19]。（四）总结质谱流式细胞术相较传统荧光流式细胞技术具有可以同时检测更多参数不需补偿、方案设计简单、灵敏度高等优点。其多参数检测的特征尤其适合对细胞表型、细胞因子、信号通路等进行深层次分析，适用于肿瘤、免疫系统疾病、传染病、血液病、药物临床试验、预后评估等方面研究。但质谱流式细胞术也存在采样较慢、清洁费时、成本较高等问题，因此还需研究人员根据自己的实验目的及需求进行选择。参考文献：1. Han GJ, Spitzer MH, Bendall SC, et al. Metal‐isotope‐tagged monoclonal antibodies for high‐dimensional mass cytometry[J]. Nat Protoc, 2018 13(10):2121-2148. DOI: 10.1038/s41596-018-0016-7.2. C. Zhang, Z. Y. Zhang, B. B. Yu, J. J. Shi, X. R. Zhang. Application fo the biological conjugate between antibody and colloid Au nanoparticle as analyte to inductively coupled plasma spectrometry. Anal.Chem. 20023. Bandura DR, Baranov VI, Ornatsky OI, et al. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time - of - flight masss pectrometry[J]. Anal Chem, 2009 81(16):6813-22. DOI: 10.1021/ac901049w.4. Bendall SC, Simonds EF, Qiu P, et al. Single‐cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum[J]. Science, 2011 332(6030):687-96. DOI: 10.1126/science.1198704.5. Di J, Liu M, Fan Y, et al. Phenotype molding of T cells in colorectal cancer by single‐cell analysis[J]. 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DOI:10.1038/s41586-021-03475-6. 【作者简介】张浩 博士 2020级北京大学口腔医学技术专业科研型博士，导师韩国军教授。硕士就读于山东大学口腔医院（导师刘少华教授），从事血管瘤临床治疗及泡沫硬化剂的改良研究，发表SCI论文4篇。目前师从韩国军教授，主要从事口腔鳞癌单细胞质谱研究及质谱病理诊断新方法研究。韩国军 研究员北京大学跨学部生物医学工程系研究员、博士生导师，北京大学口腔医院双聘博士生导师。2013年毕业于清华大学化学系（导师张新荣教授），2013至2020年在美国斯坦福大学医学院Mass Cytometry创始人Garry Nolan课题组从事新一代质谱流式相关技术与临床医学应用研究。曾获教育部自然科学一等奖，并在Nature Communications、Nature Protocols、Cell Reports、Angew Chem、Anal Chem、Cytometry等发表论文20余篇。目前主要从事质谱新技术在临床医学中应用研究，与北京大学口腔医院、北京大学第三医院、北京大学第一医院开展单细胞质谱流式临床精准医学研究。点击查看流式细胞仪专场Webinar预告（点击报名）专家约稿招募：若您有生命科学相关研究、技术、应用、经验等愿意以约稿形式共享，欢迎邮件投稿或沟通邮箱：liuld@instrument.com.cn微信/电话：13683372576扫码关注【3i生仪社】，解锁生命科学行业资讯！

2001年，科学家提出了一种使用过渡元素标记抗体，并利用抗体和待测样品的免疫结合，最终通过ICP质谱或ICP发射光谱进行检测的方法，由此开启了质谱流式的纪元。质谱流式技术（Mass Cytometry）也称为飞行时间流式细胞仪 (CyTOF)，融合了流式细胞仪的实验平台和元素质谱，结合了传统流式技术高效的单细胞研究能力和飞行时间质谱的全谱高分辨率优势。本届流式细胞网络大会特别设立【质谱流式技术及应用】分会场，来自多家知名高校、科研院所、医疗机构专家交流关于质谱流式技术在基础科研、临床医学中的应用进展。 部分精彩报告预览 报告题目：质谱组织成像技术结合MHC四聚体染色观测抗原特异性T细胞报告嘉宾：付国厦门大学 医学院 教授【摘要】 抗原特异性T细胞在抗病毒和抗肿瘤免疫反应中发挥着至关重要的作用。它们的数量，分布和功能是重要的检测指标，特别是它们在组织原位的状态可以帮助研究人员对免疫反应进行评估。现有的免疫荧光显微镜观察方法可检测的通道数目有限，无法提供高维度的分析。我们尝试利用质谱组织成像技术的高维度特点结合MHC四聚体对抗原特异性T细胞进行原位染色和检测，初步证明了这种方法的可行性和应用价值。报告题目：质谱流式技术--从基础科研到临床应用报告嘉宾：季庆华 浙江普罗亭健康科技有限公司 技术总监【摘要】 质谱流式技术作为一种全新的流式技术，采用了金属同位素来标记抗体，并通过飞行时间质谱来检测金属同位素的含量。每种金属同位素作为一个检测通道，通道之间互不干扰，避免了补偿计算的误差，可实现数百万个细胞的超多参数同步检测，可以帮助临床更深入地了解机体的免疫状态，辅助疾病的诊断及疗效检测，指导临床治疗方案。报告题目：单细胞蛋白检测系统研制及临床应用报告嘉宾：丁显廷 上海交通大学 特聘教授【摘要】 蛋白是生命活动的物质基础。在单细胞水平开展多重功能蛋白的精密测量，能够揭示细胞间异质性，还能充分利用稀有珍贵生物临床样本，是体外诊断、精准医学、生命基础科研、新药创制等领域不可或缺的基础技术能力。单细胞的痕量蛋白捕获富集、微量精准特异检测、高维蛋白互作分析，是单细胞蛋白研究领域三个必不可少、紧密关联、层层递进的研究方向。捕获富集需要材料科学和微纳制造的创新、微量定量检测需要分析化学和机械工程的攻关、互作分析需要生命科学和临床医学的基础。报告将讨论近期的一些科研进展和临床应用。报告题目：质谱流式技术在CAR-T细胞治疗中的最新应用进展及样本制备、数据分析技巧分享报告嘉宾：原丽华 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 高级工程师【摘要】 质谱流式技术作为新一代的单细胞蛋白质组学工具可以在更高维度上对免疫系统进行解析，已经应用在肿瘤免疫、感染免疫等众多领域。在CAR-T细胞治疗回输后免疫系统重建评估和免疫监测方面也可提供有效的临床信息，帮助改善临床转归。本次报告结合我们在质谱流式样本制备、上机检测、数据分析和后期维护中的一些体会和大家做一个分享。报告题目：Integrated Spatial Multi-Omics Analysis Reveals Regional Features and cGAS Pathway Involvement in HCC Response to Combined TACE and ICB Treatment: A Clinical Trial Study报告嘉宾：盛剑鹏 浙江大学 特聘研究员/副研究员【摘要】 Hepatocellular carcinoma (HCC) remains a significant clinical challenge due to the complex tumor microenvironment and limited responses to treatments. In this clinical trial study, we developed a comprehensive spatial multi-omics framework, encompassing spatial proteomics, spatial transcriptomics, single-cell RNA sequencing (scRNA-seq), and bulk transcriptomics, for HCC clinical trials involving combined Transarterial Chemoembolization (TACE) and Immune Checkpoint Blockade (ICB) treatments. This approach enabled the identification of opposing regional and interactional features influencing HCC response to TACE and ICB therapies. We observed that responsive and non-responsive features coexist before treatment, but successful TACE and ICB therapy enrich regional anti-tumor features through the cyclic cGAS pathway after treatment. Furthermore, we employed a Graphical classification model based on spatial similarity to predict HCC response to the combined treatment. Our findings provide valuable insights into the complex interactions and pathways that determine HCC treatment outcomes, paving the way for improved therapeutic strategies and personalized medicine. 此外，浙江普罗亭健康科技有限公司也将在本会场围绕质谱流式细胞仪从科研应用到临床应用的发展进程。以上仅为部分报告嘉宾预告，更多精彩内容请查看会议页面：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/icfcm2023/ iCFCM 2023 交流群 温馨提示:1) 报名后，直播前助教会统一审核，审核通过后，会发送参会链接给报名手机号。填写不完整或填写内容敷衍将不予审核。2) 通过审核后，会议当天您将收到短信提醒。点击短信链接，输入报名手机号，即可参会。会议海报