喂球机

三维多细胞类球体（肿瘤球、微球、类器官）可以帮助我们在临床前药物筛选阶段更好地预测多种候选药物的潜在作用。但是，相较于二维单层培养细胞，采用三维培养细胞模型系统进行检测分析则更具挑战性。一起来看看珀金埃尔默是如何分析3D微组织球三维体积与分区的吧！3D微组织球的制备和成像过程使用 CellCarrier Spheroid ULA 96 孔微孔板制备细胞球在CellCarrier Spheroid表面极低吸附力96孔微孔板（珀金埃尔默公司，货号6055330）中接种 HeLa 细胞，细胞浓度分别为1.25E3、2.5E3与5E3。48小时后，以3.7%甲醇固定，再用DRAQ5™ 染料对胞核染色。如前文所述，用磷酸化组蛋白H3抗体（西格玛奥德里奇公司，货号H9908）和Alexa 546二抗体（美国生命技术公司，货号A11081）联合标记有丝分裂细胞。为达到快速成像的需求，本实验应用长工作距离物镜，使用表面低吸附力的U形96孔板直接成像。对于高分辨率深度成像试验，本实验将细胞球转入兼容高质量成像CellCarrier 384孔超微孔板（珀金埃尔默公司，货号6057300），然后利用ScaleA2试剂进行透明化处理。 “预扫描（PreciScan）”功能大大缩短图像采集时间并减小数据量研究人员利用Harmony软件的“预扫描（PreciScan）”功能扫描拍摄所有细胞球的图像。“预扫描（PreciScan）”是一项智能图像采集功能，它可以智能识别确定各孔内目标细胞的x/y坐标位置。通过低倍预扫描、智能联机分析和高倍再扫描，生成目标细胞的高分辨率图像。再扫描可以包含z-stack多层扫描和 / 或时间序列扫描。“预扫描（PreciScan）”功能有效节省了测量和分析时间并减小了数据储存空间（例如，使用20x物镜对在384孔微孔板内培养的细胞球进行观察分析时，预扫描可帮助减少25倍的分析时间和数据储存空间；而使用40x物镜观察时，可减少100倍的分析时间和数据储存空间），Operetta CLS与Opera Phenix系统都配置有这一功能。利用水浸物镜与光透明化技术优化成像深度使用水浸物镜，大大提高了成像质量，特别是提升了Z轴分辨率。此外，光透明化处理进一步改善了成像深度。光透明化处理不仅提高了样品内指标的均一性，而且减少了光散射和光学像差。在此基础上，采用长波长染色（如可行）也有利于减少光散射并提高透光率，使更多的激光照射在3D样品上。因此，可显著提升成像深度和信号检测效率。3D微组织球重构与分析生成三维或 XYZ 轴图像生成三维样品的 XYZ 轴或三维图像；在三维空间中变换样品图像——旋转、缩放或平移；导出视频——三维重建或涵盖多层平面视图的视频。定位细胞球与胞核使用“定位图像区域（Find Image Region）”功能定位整个细胞球；采用局部光强阈值进行 Z 轴光衰减补偿；选用一种“定位胞核（Find Nuclei）”方法——专门用于 3D 图像胞核分割。计算细胞球与胞核三维指标使用“计算形态特性参数（Calculate Morphology Properties）”工具分析细胞球和球体内单细胞的三维形态特征。胞球体积[μm3]球度[-]覆盖面积[μm3]细胞球高度[μm]155902000.7780314286定位有丝分裂细胞使用“定位胞核（Find Nuclei）”功能，根据局部光强阈值定位有丝分裂、 pHH3 阳性细胞；使用“裁剪区（Clip Box）”功能生成剖视图，从内部（右侧）观察细胞球。使用“裁剪区（Clip Box）”工具生成剖视图进行细胞分区，分析有丝分裂细胞分布情况计算出每个胞核到细胞球边界的最短距离；使用“选择区域”和“选择细胞群”功能，将胞核分成不同区域。可随意调整区域宽度；分析每个区域有丝分裂细胞数量和空间分布差异，得到各种不同的分析数据（例如，细胞形态参数）。使用“裁剪区（Clip Box）”工具生成剖视图基于Harmony4.8软件的整体成像细胞球三维分析方法我们可以检测到细胞球整体的形态学特征和细胞球同心区单细胞特性。采用DRAQ5™ 染料（红色）和pHH3抗体（橙色）标记细胞球，然后用ScaleA2试剂进行光透明化处理5天。使用Opera Phenix或Operetta CLS系统装配的20x水浸物镜（数值孔径1.0）和间距为1μm的 z-stack模块（z轴扫描高度：300μm）记录共聚焦三维图像。Opera Phenix系统的3D成像质量最佳。经实验发现，Operetta CLS系统在被测HeLa细胞球的成像深度和胞核检测性能方面与之不相上下。此处第4和第5步骤操作仅以Opera Phenix系统成像展示，Operetta CLS系统成像效果与之相当。参考文献1. Kriston-Vizi, J., Flotow, H. (2017). Getting the whole picture: high content screening using three-dimensional cellular model systems and whole animal assays. Cytometry, 91: 152–159. doi:10.1002/cyto.a.229072. User’ s Guide to Cell Carrier Spheroid ULA microplates. PerkinElmer.3. Smyrek, I., Stelzer, EH. (2017) Quantitative three-dimensional evaluation of immunofluorescence staining for large whole mount spheroids with light sheet microscopy. Biomed Opt Express, 8(2): 484-499. doi: 10.1364/ BOE.8.0004844. Hama, H., Kurakowa, H., Kawano, H. Ando, R., Shimogori, T., Noda, H., Fukami, K., Sakaue-Sawano, A., Miyawaki, A. (2011). Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience, vol. 14: 1481–1488. doi.org/10.1038/nn.29285. Five top tips for a successful high-content screening assay using a 3D cell model system. PerkinElmer Brief.6. Letzsch, S., Boettcher, K., Schreiner, A. (2018). Clearing strategies for 3D Spheroids. PerkinElmer Technical Note.7. Boettcher, K., Schreiner, A. (2016). The benefits of automated water immersion lenses for high-content screening. PerkinElmer Technical Note.关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn。

当前新冠疫情之下，流感在全国各地又呈爆发之势，流感的防控刻不容缓，这也对各级医院针对流感的诊断和治疗提出了更高的要求。因流感发病具有“快”和“急”的特点，所以流感病毒快速抗原检测是目前临床初筛的主要手段，其准确性起到至关重要的作用，直接影响了后续的临床处理手段。为什么今年夏季流感活跃度抬高？江西省报告，今年3月中旬以来流感的优势毒株发生了变化，而A(H3N2)季节流感病毒株近两年相对沉寂，群众的免疫水平偏低，且这一型别流感毒株易引发夏季流行高峰，导致今年夏季季节性A(H3N2)型流感活跃度增高。中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心主任王大燕研究员预测，今年的流感会对医疗机构造成压力，同时也会出现严重的病例。目前临床上流感病毒抗原检测普遍使用胶体金技术，其灵敏度和特异性存在较大的局限性，无法满足临床需求。因此，临床上急需准确性高的流感快速抗原检测试剂以满足患者需求。亿立方基于荧光纳米微球技术，成功开发了流感荧光免疫层析抗原检测试剂，是国内首个采用该技术的高灵敏度流感抗原检测试剂，2019年获广东省科技进步奖。用市面认可度高的流感核酸检测试剂检出的阳性样本和阴性样本，分别用亿立方荧光纳米微球方法与市场认可度高的胶体金法对照。可以看出亿立方荧光纳米微球方法远高于胶体金法的准确性。以下分别是10份阳性结果和10份阴性结果的对照表。备注：“-”：阴性，“+”：阳性， “++”：强阳性。PCR检测的亚型包括：H1N1、H3N2、H7N9、H5N1、H9N2、B/Victoria、B/Yamagata.

制剂的一池春水正悄然被“微球”这种技术吹皱。即便是多种多样的领域，小小的“微球”都会帮助研究者获得更好的效果——那些需要缓慢释放或是维持活性的成分，可以通过制备成微球的方式来达到预期目标——例如医学上已有药物的剂型创新，又或是农药与化肥的用法改革。相比单纯地开发新药或新化合物，创新制剂的优势非常明显。目前全球发行新分子实体越来越难，而制剂创新具有研发周期短、投入少、风险低的特点，且有效性和安全性又有保障，成为不少高校科研或大型企业的开发方向。那么，如此神奇的“微球”到底是一种什么样的制剂方式呢？微球（microsphere）是指活性成分分散或被吸附在高分子、聚合物基质中而形成的微粒分散体系。微球粒径范围一般为1~500um，极值为几纳米至800um，其中粒径大于500nm的称为微米微球，小于500nm的通常称为纳米球或纳米粒，属于胶体范畴。制备微球的载体材料很多，主要分为天然高分子微球（如淀粉微球，白蛋白微球，明胶微球，壳聚糖等）和合成聚合物微球（如聚乳酸微球）。微球制剂既能通过调节和控制药物的释放速度实现长效的目的，又能保护药物不受体内酶的影响而降解，掩盖药物的不良口味，减少给药次数和药物刺激，降低毒性和不良反应，提高疗效。 此外，微球还与某些细胞组织有特殊亲和性， 能被器官组织的网状内皮系统所内吞或被细胞融合， 集中于靶区逐步扩散释出药物或被溶酶体中的酶降解而释出药物, 从而起到靶向治疗的作用。因此药物微球的有三大生物学特点：缓释性、靶向性、栓塞性。 而在农药或化肥的用法上，则是针对农作物的植物学特性，侧重利用微球的缓释性和靶向性。以天然高分子为载体的农药缓释微球的制备方法包括挤出-外源凝胶法、乳化-凝胶法(乳化-外源凝胶法和乳化-内源凝胶法)、乳化-溶剂挥发法(单乳液法、双乳液法)等，不同制备方式对微球结构、粒径、包埋率、缓释等性能都有不同影响。在制备过程中，研发阶段亟需考虑到转化为中试或生产时的连贯性。德国艾卡著名的“一比一等比例放大”为科研的实业化提供完美的解决方案。小试阶段，T25数显型分散机（均质乳化机）可实现高效的乳化，在化学交联完成后进一步完成完美乳化。在100～200 ml的制剂中，通过优化转速、时间和分散机缓慢移动，即可迅速获得理想粒径。诸多研发实验室已从T25数显型分散机上受益——无论是所得微球的粒径分布还是活性或效果，都成为制剂创新中的重要一环。 T25数显型分散机曾获得红点大奖 关于红点大奖"红点奖"为举世公认的针对卓越设计的最具分量的奖项之一从1955年，德国著名设计协会给国际上出色的产品设计颁以其出色的红点标记。该奖涵盖时尚以及消费电子界的设计，乃至汽车、家居用品以及家具。目前，生产厂家以及工业产品设计师可以在红点的31个类别中投放作品。