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生物发光技术在细胞学检测中的应用摘要:本文就生物发光技术的种类、机理、及其技术特点进行了综述,并就其在细胞学检测中的应用与研究进展展开了讨论。关键词:生物发光; ATP;荧光素酶;细胞凋亡;细胞内游离Ca2+自从20多年前,Marlene A DeLuca’s第一个成功的获得表达萤火虫荧光素酶基因(luc基因)的转基因烟草以来,生物发光(Bioluminescenc,BL)作为一个古老而又年轻的技术, 近年来得到了很大的发展和广泛的应用。而近几年来,随着分子生物学的进展以及一些新生物技术工具的出现,尤其在某些关键技术如生物传感器、基因序列分析、活体细胞ATP 测定]等方面取得了一些突破,使生物发光的应用进入了一个新时代,极大提高了生物发光的检测和快速应用,其应用范围更进一步扩大[1]。1 生物发光的种类和特点尽管自然界中的生物体普遍存在发光现象,它们的发光机理、强度和光谱范围存在着很大差异。目前,国际上根据发光的机理不同将生物发光分为:受激荧光,发光生物发光,化学发光和生物的超微弱发光[3,4]。1.1 受激荧光受激荧光是指生物体在受到外界光辐射的作用时,体内固有的荧光物质或吸收的荧光标记物发光的现象。在生物学领域中,由于分析物质荧光的方法敏感性极高,而且几乎所有的有机分子都能够直接或经过适当的化学处理后发生荧光,故很早就受到重视,并逐渐发展成为生物学和医学中的荧光分析。在生物医学领域应用荧光分析最多的是荧光显微技术,基本工具为荧光显微镜。但一般的荧光显微镜某些情况下荧光的亮度不足,使观察困难随着光电技术和计算机技术的进步,已经发展出的激光共聚焦显微镜,操作更加方便,实验可重复性提高,使受激荧光的应用更加广泛[5]。1.2 发光生物发光在生物发光领域中最容易被人们所接受的发光现象就是以萤火虫的闪光为代表的发光生物发光[3]。现在,已了解各种发光生物发光的基本反应,在这个领域中也取得了一些新的进展,例如在体外重组虫荧光素酶,用基因工程技术在大肠杆菌中表达;人工合成荧光素;体外模拟细菌发光体系已获成功;细菌的发光基因已被提出,同样也已用基因工程方法在大肠杆菌中表达。水母发光蛋白已经分离纯化,一级结构已经清楚。由于生物发光的量子效率极高,所以研究生物发光能量的转化具有重要的理论与实际意义。近年来被广泛应用的发光蛋白,如GFP、YFP、CFP 等,其发光原理就是源自动物的自发发光,从而为生物医学研究提供了新的手段[6]。1.3 化学发光化学发光是在化学反应过程中(主要为氧化还原反应)发出可见光的现象[6]。化学发光反应是由两个关键步骤组成:激发和发射。许多化学反应进行时能释放足够的自由能而把参加反应的物质之一激发到能发射光的电子激发态,生成一种激发态产物,在它回到基态时,剩余能量转变成光子能量产生发光现象。随着化学发光物质合成技术的进步,化学发光在生物医学及其它领域的应用越来越广泛[7,8],将化学发光与免疫反应结合起来建立的化学发光免疫测定法和化学发光标记是继荧光标记,放射性核素标记,酶标记三大标记技术之后,发展起来的最新检测技术[8]。1.4 生物超微弱发光 随着生物发光研究的进一步深入,发现人体的器官、组织、细胞、乃至大分子都在发光,不过发光强度更弱。这些有关生物超微弱发光(ultra-weak bioluminescence)的研究课题,构成了当前生命科学发展前沿中的一个极其重要的研究领域——生命系统的超微弱光子辐射(ultra-weak photon emission from living system) [8]。20世纪60~70 年代以来,各国先后出现了一些研究小组专门进行这方面的探讨,如日本的稻场文男小组(1991)研究了鼠肝核的超微弱天然光子发射;德国F.A. Popp小组提出了“生物光子”概念和一系列的相干理论[9]。目前研究已涉及到细胞、亚细胞乃至生物大分子的层次[ 9,10]。越来越多的实验表明,DNA 是生物超微弱发光的一个辐射源。1.5 生物发光特点研究发现生物发光有以下几个特点:① 生物发光的颜色范围很宽,可从红光到深蓝光;② 氧是几乎所有生物发光系统中必须的因素;③ 生物发光是由“荧光素酶”与“荧光素”的化学反应所引起的;④ 所有的生物发光反应似乎都是酶-底物类型的反应,但复杂程度不同,某些生物发光反应涉及3 种或4种底物,而另一些生物发光反应甚至需要3个或4个酶的体系[8]。[/size]
原标题 “纳米生物间谍”技术能进入活细胞取样 可用于深入揭示线粒体基因组变异的重要性 科技日报讯 据物理学家组织网近日报道,美国加利福尼亚大学圣克鲁兹分校(UCSC)研究人员开发出一种机器人式的“纳米生物间谍”系统,能从单个活细胞内提取出微量样本,进行RNA或DNA测序,而不会杀死细胞。研究人员表示,这种单细胞“纳米生物间谍”技术是一种了解活细胞内部动态过程的有力工具。相关论文发表在最近出版的美国化学协会《纳米》杂志上。 “我们能从活细胞中拿走一个‘生物间谍’,再把它送回该细胞,在几天内这样重复多次而不会杀死细胞。如果用其他技术,你不得不牺牲这个细胞才能分析它。”该生物传感与生物电技术小组负责人、UCSC巴斯金工程学院生物分子工程教授内德·波曼德说。 “纳米生物间谍”平台是研究小组用纳米吸液管开发的最新设备。纳米吸液管是一种小玻璃管,取液端越来越细,至尖端直径仅50到100纳米。波曼德说:“我能在实验室造出纳米吸液管,这不需要昂贵的纳米制造设备。但要进入一个细胞,问题是即使在高倍显微镜下,你也看不见吸液管尖端,不知道它偏离了细胞有多远。” 实验室博士后研究员亚当·赛格尔解决了这一问题。他基于在一台改造过的扫描离子电导显微镜(SICM),开发出一种反馈控制系统。该系统能利用通过纳米吸液管尖端的离子流作为反馈信号,在尖端接近细胞表面时探测其中的液滴。在尖端进入细胞之前,一种自动控制系统能定位它在细胞上面的位置,然后尖端很快插入穿透细胞膜,通过操控电压有控制地提取一小点细胞内物质。由于吸液管尖端极精细,对细胞造成的损害极微小。 研究小组用这种系统从活细胞中提取的微量细胞物质,估计只有50毫微微升(千万亿分之一升),约一个人体细胞百分之一的量。他们从单个人体癌细胞中提取物质并进行RNA测序,还从人类成纤维细胞中提取了线粒体并对其进行了DNA测序。“人们已经知道,线粒体和多种神经退化疾病有关。该技术可用于深入揭示线粒体基因组变异的重要性。”波曼德说。 该技术应用前景广阔。波曼德希望能与其他研究人员合作,探索其更多用途。“对于癌症生物学家、干细胞生物学家等想要了解细胞内部情况的科学家来说,这是一种多功能的平台。”(常丽君)来源:中国科技网-科技日报 2014年01月20日
近日来自哈佛大学、麻省理工学院以及瑞士苏黎世联邦高等工业学院的研究人员在新研究中成功地将生物“计算机”诊断网络导入到人类细胞中,这种生物网络通过对5种肿瘤特异性分子进行逻辑组合分析识别出了特异的癌细胞,并触发了这些癌细胞的毁灭过程。这一研究成果在线发表在9月2日的《科学》(Science)杂志上。文章的通讯作者是哈佛大学系统生物学中心的生物工程学家Yaakov Benenson及麻省理工大学的Ron Weiss教授。Benenson长期致力于开发在活体细胞内运作的生物计算机。生物计算机是一种完全由DNA、RNA及蛋白质构成的分子自动机(molecular automata),它们的“输入”是细胞质中的RNA、蛋白质以及其他化学物质,“输出”的则是很容易辨别的分子信号。由于生物计算机能够探测和监控基因突变等细胞内一切活动的特征信息,因此它们可以确定癌细胞等病变细胞。此外,它们还能够自动激发微小剂量的治疗行为。利用这些“分子医生”将有望引发人类医学的重大变革——明确地对人体病变细胞或组织进行治疗,而健康的细胞完全不会受到干扰。不过,要最终实现这一目标,还有很长的路要走。科学家近期进行的一些相关研究,大都是尝试以不同方式开发具有多种用途的生物计算机。在这篇文章中,研究人员成功构建了一个多基因合成“电路”,此电路负责鉴别肿瘤细胞与正常细胞,进而靶向性摧毁识别的肿瘤细胞。其具体工作原理是:对细胞内5种肿瘤特异性分子及出现频率进行抽样及综合分析。是由当5种因子同时在细胞内出现时,该电路才做出正识别响应。这使得肿瘤检测的精确性大大增高。研究人员希望这一成果能为开发出特异的抗癌治疗奠定基础。随后科学家们用这一多基因合成网络对实验室中培养的两种人类细胞Hela细胞(一种子宫颈癌细胞)和正常细胞进行了检测。当遗传生物计算机被导入到这两种不同的细胞类型中时,只有Hela细胞被摧毁,而正常细胞则安然无恙。获得这一结果并非易事,研究人员为之投入了大量的基础工作。Benenson及同时首先针对正常健康细胞和Hela细胞中的miRNA分子进行了高通量筛查,最终确定了能将Hela细胞从健康细胞中鉴别出的5种特定的miRNA组合。“这些miRNA分子被导入到细胞中进行检测。新型的生物计算机利用诸如‘是’与‘非’的逻辑运算对这五种miRNA分子进行组合。只有当对所有分子的整体运算结果为逻辑‘真’时才会生成需要的结果——即促使细胞死亡,”Benenson说。目前研究人员已确定这一生物计算机网络在活细胞中能够非常稳定地工作,准确组合所有细胞内因子并生成正确答案,这代表着研究者们在该领域又向前迈进了重要的一步。 http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/201109/2011090911135106.jpgdoi:10.1126/science.1205527 PMC:PMID:Multi-Input RNAi-Based Logic Circuit for Identification of Specific Cancer CellsZhen Xie, Liliana Wroblewska, Laura Prochazka, Ron Weiss, Yaakov BenensonEngineered biological systems that integrate multi-input sensing, sophisticated information processing, and precisely regulated actuation in living cells could be useful in a variety of applications. For example, anticancer therapies could be engineered to detect and respond to complex cellular conditions in individual cells with high specificity. Here, we show a scalable transcriptional/posttranscriptional synthetic regulatory circuit—a cell-type “classifier”—that senses expression levels of a customizable set of endogenous microRNAs and triggers a cellular response only if the expression levels match a predetermined profile of interest. We demonstrate that a HeLa cancer cell classifier selectively identifies HeLa cells and triggers apoptosis without affecting non-HeLa cell types. This approach also provides a general platform for programmed responses to other complex cell states.