生物成像激光剥蚀系统

转自于‘无机分析化学’公众号，版权归其所有引用格式：李冬月，郑令娜，常盼盼，等．基于低分散激光剥蚀系统-电感耦合等离子体飞行时间质谱的快速元素成像[J/OL]．中国无机分析化学. https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.6005.O6.20220328.1715.002.html壹研究背景“ 生物体内的微量元素虽然含量低，却参与许多重要的生理过程，还与多种疾病的发生密切相关。随着科学研究的深入，不但需要得到生物样品中元素总量和元素形态的信息，还要获得样品中元素的空间分布，这为分析化学提出了新的挑战。在LA-ICP-MS进行生物元素成像分析时，高能量激光微束轰击剥蚀池中的生物切片表面，产生的气溶胶由载气吹扫进入ICP-MS，检测得到剥蚀区域的元素信息，再将切片上每个剥蚀微区的结果重构，得到元素成像图。同时，新一代电感耦合等离子体飞行时间质谱(ICP-TOFMS)可以在不到50 μs的时间内得到从6Li-238U的全质谱图。随着新一代LA-ICP-MS的发展，需要发展与之匹配的成像方法，以实现快速的生物元素成像。贰研究进展“ 1. 优化快速成像条件LA-ICP-MS的元素成像可采用点剥蚀模式或线剥蚀模式(图1)。A为点剥蚀模式，使用低分散快速剥蚀池；B为线剥蚀模式，使用常规剥蚀池图1 两种剥蚀模式示意图使用的低分散快速激光剥蚀系统，配备了快速洗脱剥蚀池和气溶胶快速引入系统(ARIS)，可以采用点剥蚀模式完成快速成像。优化剥蚀池载气流速，可以得到最佳的SPR。当内池He流量为0.4 L/min，外池He流量为0.2 L/min时，得到最佳SPR(20 ms±1 ms)，此时可以实现每秒40像素的成像速度。理论上越小的激光光斑能获得更高的空间分辨率，但由于成像时间的限制，本文采用20 µ m的方形光斑。在点剥蚀模式下，样品台移动速度设为800 µ m/s(20 µ m×40 Hz)。LA-ICP-MS成像还要求质谱仪具有快速分析瞬时信号的能力，同时能消除谱学偏离(Spectral Skew)产生的结果偏差。顺序扫描的四级杆ICP-MS在测量时，每个核素测量需要毫秒量级的驻留时间(Dwell Time)和稳定时间(Settling Time)，限制了其分析瞬时信号中核素的个数。与四级杆ICP-MS不同， 本文采用的ICP-TOFMS分析速度快，能够在46 μs得到一张全质谱图(即波形，waveform)，适合分析瞬时信号。为了获得更好的信噪比，本文将516张质谱图叠加，这样每个像素点的采样时间为23.74 ms，与SPR时间匹配以得到最优的成像结果。此外，在全谱测量时，由于存在高浓度的基体离子，会造成ICP-TOFMS检测器的饱和。本文使用的ICP-TOFMS采用陷波技术(Notch Filter)，选择将质荷比为28、32、40、80等四个质量数的基体离子去除，消除了基体离子的影响。2.LA-ICP-TOFMS小鼠肾脏的元素成像使用LA-ICP-MS对暴露AgNP的小鼠肾切片中Ag和其他多种生物微量元素快速成像，采用点剥蚀模式，以20 µ m的分辨率分析尺寸为14 mm× 7 mm的肾脏切片，分析时间约为2 h。与常规的LA-ICP-MS系统相比，成像速度提高了约一个数量级。图2 展示了19种元素成像图，其他元素由于含量低或基体离子干扰，没有得到清晰的成像结果。如果采用碰撞池技术，可以消除多原子离子的干扰，提高52Cr、56Fe、80Se等核素的成像效果。由图2可见，不同元素在肾切片中具有不同分布模式。P和S等主量元素，在肾脏切片基本呈均匀分布；Na在肾髓质中含量较高，这与Na+参与形成肾髓质高渗透压的结论相一致；Mn与Na的分布相反，在肾髓质和肾皮质的交界处含量较高，而在肾椎体中含量较低，呈现出中空的图像；由于肾皮质中血流量远远大于肾髓质，因此肾皮质的Fe含量(主要来自血细胞)较高。Ag并不是生命必需元素，在生物体内的背景很低，因此图2中Ag的信号可以认为来自于注射的AgNP。可以看出，AgNP在肾皮质及肾皮质与肾髓质交界区域含量较高，特别是在肾皮质和肾髓质交界处的含量高于肾皮质区，而在肾椎体中含量很低。图2 小鼠肾组织切片元素成像图图3是P、Mn和Ag三种元素合并图，可以直观地看出不同元素在肾切片中的不同分布。总之，元素成像可以得到微量元素及金属纳米颗粒在不同微区的原位分布，为微量元素的微区代谢、金属纳米材料吸收、分布和转运等生物医学研究提供了直观可靠的分析手段。 图3 肾组织切片中P、Mn和Ag叠加元素成像图叁创新点“ 使用低分散激光剥蚀系统与电感耦合等离子体飞行时间质谱联用，建立了新的基于点剥蚀的成像模式，实现了对小鼠肾脏切片的快速、高分辨的多元素成像。LA-ICP-TOFMS成像方法为原位研究生物体内元素提供了直观可靠的手段，有望在生物医学研究中得到更广泛的应用。专家介绍竺云，女，天津师范大学物理与材料科学副教授。2002年6月毕业于武汉大学物理系，2007年6月毕业于中国科学院物理研究所，获博士学位。2007年7月至2008年9月在香港理工大学做博士后，2008年9月到天津师范大学物理与材料科学学院任职。2018年1月至2018年12月在美国休斯顿大学任访问学者。主要从事磁记录介质材料薄膜的制备和性能研究、反常霍尔效应的应用等研究。王萌，男，中国科学院高能物理研究所副研究员。2000年7月本科毕业于南京大学化学化工学院，2008年3月在中国科学院高能物理研究所获理学博士学位。现在主要从事微量元素的化学形态、生物效应及相关分析方法学的研究。主持和参与过国家重点研发计划、国家自然科学基金、中国博士后基金等科研项目。已发表SCI论文50多篇，H-index为23。

2023年4月26日，中国科学院高能物理研究所测试中心与Teledyne Photon Machines公司的“激光剥蚀元素成像实验室”揭牌仪式在北京中国科学院高能物理研究所成功召开。合作实验室揭牌仪式“激光剥蚀元素成像实验室”立足于各自未来发展战略需求，双方希望通过合作，优势互补，共同推动激光剥蚀技术在中国的本土化应用。“激光剥蚀元素成像实验室”将开展新型超快速准分子激光剥蚀成像系统IRIDIA仪器联用电感耦合等离子体飞行时间质谱成像系统（LA-ICP-TOFMS）在生物、临床医学及其他新兴拓展应用领域方面的工作。IRIDIA超快速准分子激光剥蚀系统可以实现微米甚至亚微米尺度超高空间分辨率，配合低分散快速洗脱时间，可以实现组织-细胞-整体动物水平上原位快速进样，从而为研究各种元素在不同基质中的代谢、吸收、转运等生物临床研究提供更加直观可靠的分析手段。IRIDIA新型超快速准分子激光剥蚀成像系统中国科学院高能物理研究所董宇辉副所长和仪真分析技术总监朱丽敏为激光剥蚀元素成像实验室揭牌同时，中国科学院高能物理研究所测试中心与TOFWERK公司的合作实验室“TOFWERK icpTOF卓越分析测试中心”也成功揭牌。中国科学院高能物理研究所测试中心和TOFWERK合作实验室揭牌合作实验室合照（从左至右依次为：仪真分析朱丽敏博士、高能所董宇辉副所长、丰伟悦研究员、TOFWERK朱亮博士以及高能所王萌研究员）空间多组学质谱技术研讨会合作实验室揭牌仪式后，同期的 “空间多组学质谱技术研讨会”正式召开，仪真分析作为协办单位积极参与。此次研讨会采用线上线下并行的模式，邀请了国内外相关领域的专家学者和企业代表共同探讨空间多组学质谱技术在生物、临床医学、环境等领域中的应用前景和发展趋势，涵盖了空间多组学质谱技术的最新进展、多种成像技术原理与方法等方面的内容。线下会议合照 与会人员在会议间隙参观了激光剥蚀元素成像实验室Teledyne Photon Machines公司全球应用专家Ciprian Stremtan 博士在线分享了题为“Successful Elemental Bioimaging – Workflow Evolution”（元素生物成像成功的关键——工作流程演化），详细阐述了LA-ICP-MS技术的发展及趋势，尤其是分享了IRIDIA激光剥蚀系统可以和市场上不同品牌的ICP-MS及ICP-TOFMS联用，介绍其在生物、临床医药、地质分析尤其是超快成像技术的应用前景。Ciprian Stremtan 博士分享激光剥蚀成像技术的最新进展会议期间，仪真分析展台人流络绎不绝，深入交流了激光剥蚀技术在空间多组学研究中的推动作用，分享各类仪器的应用进展，探讨相应解决方案，现场反响热烈。 仪真分析展台一隅相关介绍中国科学院高能物理研究所是我国从事高能物理研究、先进加速器物理与技术研究及开发利用、先进射线技术与应用的综合性研究基地。其检测分析与测试平台以中国科学院高能物理研究所测试中心为依托。Teledyne Photon Machines公司多年来致力于为电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS)、ICP-TOFMS等提供前处理解决方案，推进基于原位微区分析的激光剥蚀技术，并在全球范围内提供全系列激光剥蚀产品，包括纳秒激光剥蚀系统和飞秒激光剥蚀系统。上海仪真分析仪器有限公司（仪真分析）与Teledyne Photon Machines公司拥有多年的紧密合作关系。仪真分析成立于2005年，是一家具备研发、集成、生产、代理、销售和技术服务的仪器供应商，为临床生物、地质分析和环境监测等分析实验室提供样品前处理到分析测试全方位解决方案。技术团队由多位留学博士及硕士和专业培训的工程师组成，在上海设有研发试验和培训实验室。

激光剥蚀成像是一种相对较新的分析技术，可以在二维乃至三维空间内实现固体样品中所关注元素的浓度分布可视化激光剥蚀（laser ablation, LA）系统将样品引入元素分析仪，通常是电感耦合等离子质谱仪（ICP-MS），通过使激光烧蚀系统和下游化学分析仪精确同步，可以在样品的不同或相同位置连续记录元素信号，以生成完整的2d或者3d元素分布图。LA-ICP-MS质谱成像技术正越来越多地应用于地质研究（Ubide等，2015年）、生物研究（Becker等，2010年）和医学研究（Hare等，2017年）。激光剥蚀ICP-MS成像系统是如何工作的？在实践中，激光剥蚀ICP-MS成像是通过在样品表面上扫描高频率脉冲激光束来实现的。通常采用的方式是：激光束固定不动，样品台在x、y和z方向上由高精度电机移动，样品台移动精度通常优于1微米。深紫外激光器（例如：193纳米波长）通常用于固体样品的剥蚀处理。激光光斑尺寸可根据所需的空间分辨率进行相应调整；先进激光剥蚀（LA）系统可提供小至1微米的激光光斑尺寸，也就是优于1微米的空间分辨率。当激光的能量密度（注量）高于某个阈值时，激光脉冲将进行样品剥蚀过程。由于此剥蚀阈值取决于特定的样品，因此需针对每种样品材料优化激光注量。剥蚀过程一般在密封的气密室（即剥蚀室）内进行。烧蚀产生的气溶胶样品在连续的载气（通常是氦气）流中被快速冲刷出烧蚀室，然后输送到下游的ICP检测系统。当气溶胶样品流动通过高能ICP系统时，其将被雾化和电离。所产生的离子将通过多级真空和相应的离子传输元件从ICP电离源传输到末端质谱分析仪。这其中也会设有能量过滤器和反应/碰撞室用于去除离子束中的干扰物质。质谱分析器（包括四极、扇形场或飞行时间质谱等）可用于测量所关注元素的强度。这些信号强度对应于烧蚀样品内元素的丰度。然后，通过在样品表面上（二维）或样品体积内（三维）已知的x，y，z坐标位置重复此烧蚀分析过程，以还原元素在样品内分布图。打破瓶颈：点分辨激光剥蚀质谱成像业内最近出现的一种趋势是开发具有快速冲刷功能的激光烧蚀室（Wang等，2013年；VanMalderen等人，2015年；Gundlach-Graham和Günther，2016年）。借助这种快速冲刷系统，可以在数毫秒内将剥蚀样品从烧蚀室中‘完整输出’，而传统系统则需要花费数秒时间。举例来说，通过使用业界俗称的双容积烧蚀室，或者通过减小载气管的内径，或者通过在气溶胶传输过程中引入额外的气体（如氩气），都可以帮助实现更快速的冲刷效果。更快速的冲刷过程缩短了整个分析过程所需的时间，不再让样品冲刷和传输成为激光剥蚀ICP质谱成像的瓶颈。此外，更快速的冲刷意味着，烧蚀气溶胶烟雾在进入ICP系统之前分布更为集中，从而在所记录的MS数据中能产生更高的信噪比，也有着更好的分析精确度。要高效适配快速冲刷烧蚀室传输到ICP-MS的样品短脉冲，特别是目标元素多达十多种乃至更多的情况下，快速质量分析技术成为必须。扫描型质量分析仪（如四极杆或扇形场等）需要按顺序测量单个元素，而飞行时间（TOF）质谱（如TOFWERK的icpTOF系统中使用的质量分析仪）则可以同时测量所有元素及其同位素信息（Borovinskaya等，2013；Hendriks等，2017）。TOFWERK icpTOF质谱仪能够每33微秒记录一张完整的质谱，有足够的‘空余’来完整捕捉测量短暂的瞬态信号（如单次激光发射的气溶胶烟羽）。通过将icpTOF系统与快速冲刷（低分散）激光烧蚀室搭配使用，可快速实现点分辨、多元素快速成像（Burger等，2017年；Bussweiler等，2017年）。在这种方法中，图像采集是通过并排激光点光栅扫描方式完成的。为了避免相邻激光点的信号重叠，激光发射的重复频率需要适配于来自单次激光发射的信号持续时间。由于特定的样本冲刷时间不等，因此需要在每次成像实验之前相应的优化激光重复频率（示例请参见TOFpilot白皮书）。激光扫描速度（微米/秒）由激光光斑尺寸（微米）和重复频率（s-1)决定。相比连续扫描成像模式（即信号连续进入ICP-MS系统），点扫描模式具有显著的优势。在点分辨成像中，每个像素即代表一个“封闭实验”，每次激光发射将在最终的图像中对应着一个具有明确坐标，且包含多元素全谱信息的单像素。因此，样品表面的原始几何形状得以多维化学组分的形式‘完整重现’，并且大大降低了产生伪影（如拖尾效应）的几率。延伸阅读Becker, J.S., Zoriy, M., Matusch, A., Wu, B., Salber, D., Palm, C. and Becker, J.S., 2010. Bioimaging of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA‐ICP‐MS). Mass spectrometry reviews, 29(1), pp.156-175.Borovinskaya, O., Hattendorf, B., Tanner, M., Gschwind, S. and Günther, D., 2013. A prototype of a new inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometer providing temporally resolved, multi-element detection of short signals generated by single particles and droplets. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 28(2), pp.226-233.Burger, M., Schwarz, G., Gundlach-Graham, A., Kä ser, D., Hattendorf, B. and Günther, D., 2017. Capabilities of laser ablation inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 32(10), pp.1946-1959.Bussweiler, Y., Borovinskaya, O. and Tanner, M., 2017. Laser Ablation and inductively coupled plasma-time-of-flight mass spectrometry-A powerful combination for high-speed multielemental imaging on the micrometer scale. Spectroscopy (Santa Monica), 32(5), pp.14-20.Bussweiler, Y., Spetzler, T., Tanner, M. and Borovinskaya, O., 2017. TOFpilot–An Integrated Control Software for the icpTOF that Enables High-Speed, High-Resolution, Multi-Element Laser Ablation Imaging in Real Time.Gundlach-Graham, A. and Günther, D., 2016. Toward faster and higher resolution LA–ICPMS imaging: on the co-evolution of LA cell design and ICPMS instrumentation. Analytical and bioanalytical chemistry, 408(11), pp.2687-2695.Hare, D.J., Kysenius, K., Paul, B., Knauer, B., Hutchinson, R.W., O’Connor, C., Fryer, F., Hennessey, T.P., Bush, A.I., Crouch, P.J. and Doble, P.A., 2017. Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry (LA-ICP-MS). Journal of visualized experiments: JoVE, (119).Hendriks, L., Gundlach-Graham, A., Hattendorf, B. and Günther, D., 2017. Characterization of a new ICP-TOFMS instrument with continuous and discrete introduction of solutions. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 32(3), pp.548-561.Ubide, T., McKenna, C.A., Chew, D.M. and Kamber, B.S., 2015. High-resolution LA-ICP-MS trace element mapping of igneous minerals: In search of magma histories. Chemical Geology, 409, pp.157-168.Van Malderen, S.J., van Elteren, J.T. and Vanhaecke, F., 2015. Development of a fast laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry cell for sub-μm scanning of layered materials. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 30(1), pp.119-125.Wang, H.A., Grolimund, D., Giesen, C., Borca, C.N., Shaw-Stewart, J.R., Bodenmiller, B. and Gü nther, D., 2013. Fast chemical imaging at high spatial resolution by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical chemistry, 85(21), pp.10107-10116.