气相分析酰氯毛细管

毛细管聚焦的微束X射线衍射仪及其应用研究邵金发，程琳*（北京师范大学核科学与技术学院，射线束技术教育部重点实验室 100875）摘要随着自然科学的不断进步，诸多领域都朝着微观层面发展，人们对物质的分析随之深入到微区范畴。微束X射线衍射分析技术是一种无损分析微小样品或样品微区物相结构的有利工具，凭借着无损、微区、空间分辨率高等特点被应用于诸多领域中。本实验室将毛细管X射线聚焦技术与X射线衍射分析技术相结合，自行设计研发了一种新型毛细管聚焦的微束X射线衍射仪。它利用毛细管X光透镜的特点，将X射线源发出的X射线束会聚到微米量级，从而实现对小样品或者样品微区的物相分析，为解决金属文物、陶瓷文物等的无损微区物相分析提供了解决方案。1. 引言微束X射线衍射(micro-X-ray diffraction，µ-XRD)是一种可靠的、无损的物相结构分析技术，已被广泛应用于生物化学、材料科学、地球科学、应力分析等领域[1-6]。目前获得微束入射X射线的方法主要有准直器限束和X射线光学器件聚焦两种。通过准直器限束获得微束入射X射线是最早在微束X射线衍射仪中使用的方法，具体为采用准直狭缝或小孔作为光阑放置在入射光路上，用以减小入射X射线的发散度。但是与此同时，入射光束的强度会因为物理阻挡而降低，导致获得的衍射信息变弱，难以达到理想的分析效果[3,4]。而多毛细管X光透镜利用X射线全反射原理，可将在空心毛细管内表面上的多次全反射的X射线会聚于一焦点。因此可以以较大的角度收集从X射线源产生的X射线，且会聚后X射线的束斑大小可低至几十微米。同时，毛细管X光透镜对Cu-Kα的能量有高达2-3个数量级的放大倍数[7]，且具有低的发散度，非常适合微小样品和样品微区物相结构无损分析的研究。目前德国Bruker公司生产的D8系列X射线衍射仪通过添加一个由微焦点X射线源和多毛细管X光透镜集成的附加模块实现μ-XRD分析的功能[8]；意大利LANDIS实验室开发了一个集成多毛细管半透镜的μ-XRD衍射[9,10]仪。但由于仪器均缺乏二维、三维自动控制平台，难以实现样品微小测量点的准确定位，更无法实现样品微区的二维μ-XRD分析。面向微小样品和样品微区µ-XRD分析的需求，本实验室自行设计和开发一种新型的微束X射线衍射仪以及相应的计算机控制程序，并且开展了相关分析方法学的研究。2. 仪器组成本实验室设计的毛细管聚焦的微束X射线衍射仪外观如图1所示，其主要由微焦斑X射线管（Cu靶，焦斑大小50 μm×50 μm）、毛细管X光透镜（Cu-Kα能量处束斑大小为100 µm）、接收狭缝、SDD X射线探测器（5.9keV时能量分辨率为145eV，铍窗有效面积25 mm2）、具有20倍放大功能的1400万像素固定焦距CCD摄像头、测角仪，XYZφ四维样品台，以及在LabVIEW语言环境下开发的仪器控制程序等部分组成。图1 微束X射线衍射仪的外观图控制程序的主界面具有微区X射线衍射分析和微区能量色散X射线荧光（micro energy dispersive X-ray fluorescence，μ-EDXRF）分析两种模式，如图2所示。谱图显示区域在探测过程中实时显示X射线探测器探测到的谱图。此外，该仪器使用的高精度自动化三维运动平台可以满足微区的二维μ-XRD分析的需求，以便实现对感兴趣区域内物相分布的分析等相关问题。图2 微束X射线衍射仪控制程序的主界面与Si (4 0 0)的X射线衍射图3. 实验分析3.1 氮化钛薄膜的分析薄膜具有强大的性能，但同时也会因为各种内部或者外部因素而发生失效。因此，薄膜微观区域特征的变化对宏观尺度特征的研究具有重要的作用。本文选择TiN薄膜作为研究对象，以期了解薄膜中TiN晶相生长的择优取向并对其进行快速评估。该TiN薄膜的是利用金属真空蒸汽电弧离子源（MEVVA）先进行离子注入，再经磁过滤真空阴极电弧沉积系统（FCVA）气相沉积而成。被测样品如图3所示，A部分和B部分是TiN薄膜，C部分为304不锈钢衬底，其中A部分更靠近整个样品的边缘，感兴趣的区域标识在中间的矩形条框中（0.5 mm×5.0 mm）。由于图中各部分形状不规则，易被常规X射线仪器的射线束无差别的覆盖，因此在这里进行微区分析十分必要。图3 TiN薄膜与304不锈钢衬底以及被测位置图片在μ-EDXRF分析模式下，X射线管电压为30 kV，管电流为0.5 mA，X射线束与样品表面的夹角θ1和X射线探测器铍窗的中心线与样品表面的夹角θ2均为45°，探测器探测活时间为60 s，测量得到的μ-EDXRF光谱见图4。同时，选择如图3中所示的感兴趣区域，使用微束X射线衍射仪进行µ-EDXRF二维扫描分析。扫描步距为50 μm，每个点的测量条件与μ-EDXRF分析保持一致，每步的探测活时间为500 ms。经过数据处理，得到扫描区域内各元素的分布如图5所示。在µ-XRD分析模式下，X射线管的设置与µ-EDXRF分析模式下相同，测角仪2θ范围为10°~120°，步距角为0.1°，每步的探测活时间为1 s，测量得到的X射线衍射图谱如图6所示。图4 TiN薄膜测量点的μ-EDXRF光谱图5 TiN薄膜扫描区域中Fe和Ti元素的分布图6 TiN薄膜测量点的μ-XRD图从图4可以看出，TiN薄膜测量点a和b的主要荧光峰来自Ti元素，同时，测得的304不锈钢衬底的主要合金元素为Fe、Ni和Cr。通过荧光峰的强度可知，a点Fe与Cr的相对含量较b点高，而b点Ti的相对含量较a点高，即b点处沉积了更多的Ti。从图5中可以看出，从中部到边缘位置Ti的含量发生了明显的改变，这主要受沉积束流在304不锈钢衬底上的覆盖面积所影响，而这种含量的改变与薄膜物相的变化有一定的联系。图6的测量结果表明，在该TiN薄膜中TiN所呈现的取向分别为（1 1 1）、（2 0 0）、（2 2 0）和（3 1 1）。在a点中最强的衍射峰来自于TiN的（2 2 0）晶面；在b点中TiN的（1 1 1）晶面呈现为最强，而（2 2 0）晶面消失了。结合图5中的元素分布可知，Ti的含量在物相变化的过程中起到了重要作用，随着沉积Ti的增加，膜内积聚的内压力促进了相变。因此，使用本微束X射线衍射仪可以实现对TiN薄膜，尤其是镀在微小零件上的薄膜的定点性能监测。同时，借助本微束X射线衍射仪，可从元素组成、元素分布、物相组成几方面对薄膜的微区进行表征。可以帮助认识了薄膜微区的性质，并为宏观的薄膜失效或者薄膜强化提供了研究数据。3.2 清代红绿彩瓷的分析为了评估本仪器对样品微区进行物相二维μ-XRD分析的能力，选取一片清代红绿彩瓷的残片作为研究对象。调节样品台使样品表面感兴趣区域清晰呈现在CCD图像中，并通过鼠标在控制界面的CCD视野中选择具体的目标扫描区域（图7）。选择图7中A（白釉），B（红彩）和C（绿彩）进行μ-XRD分析。µ-XRD分析的测量条件与上文保持一致，所得μ-XRD图如图8所示。从图8中可以看出，A点白釉XRD谱图在15 °~35 °之间出现一个驼峰，这是白釉在高温烧制过程中形成的非晶相所致；同时，经过对比ICCD PDF卡，A点白釉中主要存在的晶相为钾长石KAlSi3O8 (PDF 25-0618)、石英SiO2 (PDF 46-1045)和莫来石3Al2O32SiO2 (PDF 15-0776)等；B点红彩中主要存在的晶相为Fe2O3 (PDF 47-1409)和石英SiO2（PDF 46-1045)等；C点绿彩中主要存在的晶相为Pb8Cu(Si2O7)3 (PDF 31-0464)等。图7 清代红绿彩瓷残片与感兴趣区域图片图8 红绿彩中白釉、红彩和绿彩的μ-XRD图此外，选择如图7中2 mm×2 mm的感兴趣区域，使用微束X射线衍射仪进行µ-XRD二维扫描分析。该区域被划分为21×21个被测试点，扫描步距为100 µm，每个点的测量条件为：X射线管电压为30 kV，电流为0.5 mA，2θ探测范围为24.5°到30.5°，步距角为0.3°，每步探测活时间为0.8 s。由此得到的扫描总谱经数据处理得到的晶相分布图如图9所示。图9 扫描区域中Pb8Cu(Si2O7)3、3Al2O32SiO2、KAlSi3O8和Fe2O3的晶相分布4. 结论本实验室将毛细管X光透镜技术与X射线衍射分析技术相结合，设计和研发成一种新型微束Ｘ射线衍射仪。该微束Ｘ射线衍射仪具备无损分析微小样品和样品微区的物相结构的能力，且能实现样品微区中感兴趣区域的μ-XRD二维扫描。同时，该仪器还可实现样品的μ-EDXRF分析和μ-EDXRF二维元素分析，可为物相结构的研究提供了元素种类的参考信息，扩展了微束Ｘ射线衍射仪的功能。因此，其在材料科学、地球科学和文物保护等领域有着广泛的应用前景。 参考文献[1] Lin C , Li M , Youshi K , et al. The study of chemical composition and elemental mappings of colored over-glaze porcelain fired in Qing Dynasty by micro-X-ray fluorescence[J]. Nuclear Inst & Methods in Physics Research B, 2011, 269(3):239-243.[2] Laclavetine K, Ager F J, Arquillo J, et al. Characterization of the new mobile confocal micro X-ray fluorescence (CXRF) system for in situ non-destructive cultural heritage analysis at the CNA: μXRF-CONCHA[J]. Microchemical Journal, 2016, 125: 62-68.[3] Figueiredo E, Pereira M, Lopes F, et al. Investigating Early/Middle Bronze Age copper and bronze axes by micro X-ray fluorescence spectrometry and neutron imaging techniques[J]. Spectrochimica Acta Part B Atomic Spectroscopy, 2016, 122:15-22.[4] Brai M, Gennaro G, Schillaci T, et al. Double pulse laser induced breakdown spectroscopy applied to natural and artificial materials from cultural heritages[J]. Spectrochimica Acta Part B Atomic Spectroscopy, 2009, 64(10):1119-1127.[5] HložEk M, Trojek T, B Komoróczy, et al. Enamel paint techniques in archaeology and their identification using XRF and micro-XRF[J]. Radiation Physics & Chemistry, 2016: S0969806X16300573.[6] Scrivano S, Ruberto C, B Gómez-Tubío, et al. In-situ non-destructive analysis of Etruscan gold jewels with the micro-XRF transportable spectrometer from CNA[J]. Journal of Archaeological Science: Reports, 2017, 16: 185-193.[7] Bonfigli, Francesca, Hampai, et al. Characterization of X-ray polycapillary optics by LiF crystal radiation detectors through confocal fluorescence microscopy[J]. Optical Materials, 2016, 58: 398-405. .[8] Berthold, C. , Bjeoumikhov, A. , & Lutz Brügemann. (2009). Fast XRD2 micro diffraction with focusing X-ray microlenses. Particle & Particle Systems Characterization, 26(3), 107-111.[9] Rotondo, G. G. , Romano, F. P. , Pappalardo, G. , Pappalardo, L. , & Rizzo, F. . (2010). Non-destructive characterization of fifty various species of pigments of archaeological and artistic interest by using the portable X-ray diffraction system of the Landis laboratory of catania. Microchemical Journal, 96(2), 252-258.[10] Padeletti, G. , Fermo, P. , Bouquillon, A. , Aucouturier, M. , & Barbe, F. . (2010). A new light on a first example of lustred majolica in Italy. Applied Physics A, 100(3), 747-761.*通讯作者程琳，工学博士，美国加州大学尔湾分校访问学者。现任职于北京师范大学核科学与技术学院，教授，博导。长期从事毛细管聚焦的微束X射线分析技术的研究及相关设备的研发；目前已经成功研发出国内首台毛细管聚焦的微束X射线荧光谱仪和毛细管聚焦的X射线衍射仪等设备并开展相关的分析技术及应用研究；作为项目负责人已经承担多项国家自然科学基金、北京市自然科学基金和北京市科技计划项目等,国家自然科学基金评审专家、北京市高新技术企业评审专家和X-ray spectrometry等国际刊物审稿人。e-mail: chenglin@bnu.edu.cn

毛细管电泳技术(Capillary Electrophoresis, CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)或毛细管分离法(CESM)，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。是80年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它是电泳技术与层析技术相结合的产物，现在所说的毛细管电泳技术(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他们使用了75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离；1984年Terabe等发展了毛细管胶束电动色谱(MECC)；1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行，建立了毛细管等电聚焦(CIEF)；同年，Cohen发表了毛细管凝胶电泳(CGF)的工作；1988&mdash 1989年出现了第一批CE商品仪器。　　但是目前很多人认为，在众多的仪器中，CE好像不是那么的热门，甚至一些从事过CE研究的人员也认为该方法前途暗淡。　　行内流行说法之一：CE近年越来越难发文章，人们的研究热情正在走下坡路。　　行内流行说法之二：由于企业和检测机构用的少，学这个就业困难。不如HPLC、GC等有前途。　　日前一名网友在仪器信息网论坛发帖称，鉴于以上的这些消极情绪，导致一些刚入门的新手们，无论他们起初是怀着多大的热情，随着时间的推移他们总会或多或少难以避免的被这些消极情绪所影响，人云亦云，失去钻研的热情。　　毛细管电泳(CE)真的&ldquo 没落&rdquo 了吗?　　以一个科研工作者的身份该，网友谈到，&ldquo CE方法已经被各种标准(包括中国药典、国标，甚至是欧洲标准)所收录，说明一直有企业或检测机构在应用该方法。而事实也正是如此，我自己所知道的就有好几家检测机构和企业配备有CE仪器。&rdquo 　　据小编了解，2010年版中国药典对盐酸头孢吡肟中N-甲基吡咯烷的检查，USP对盐酸罗哌卡因的对映体纯度检查，均采用毛细管电泳法测定。　　另外，该网友谈到，任何仪器都只不过是一种方法媒介，如果你&ldquo 矢志不渝&rdquo 的认为CE没前途，那么你有没有对你的课题有一个整体的认识呢?又或者，你有没可能通过这个课题对这个领域有一个系统的认识?举个例子，比如你的课题是有关CE在某种中药检测中的应用。那么你在毕业前应该要掌握以下几点：该药物的使用历史、功效、研究现状、特征组份等；涉及该药物的检测方法；该药物的功效和对应功效的活性成分；如何进行质量控制等。该网友说，如果你具备了这些知识，面试的时候就不会只是一脸无辜的说，&ldquo 我做CE出身的&rdquo 。　　十八般兵器样样精通那是不可能的。其实退一步说，就算相对于LC、GC来说CE有点偏门，但学校学的是&ldquo 渔&rdquo 的手段，也就是分析问题，解决问题的能力，一法通万法通。所以，困心横虑中的从事CE研究的同学们，是不是不那么煎熬啦?　　其实，每一种好的仪器，研究和应用都需要大家的推动，如果我们放弃了，这种仪器的未来也就被放弃了。所以，从事CE研究的人们，或许你们今天的研究就能够推动CE的发展，加油!　　对于&ldquo 行内流行说法之一&rdquo ，该网友会在7月份开新帖，以数据说话，大家敬请期待!　　原帖：写给从事CE研究的研究生们--我们为何不屈不挠的浸泡在哀伤里?

毛细管电泳技术在蛋白药物研发和质量控制中的发展 随着蛋白药物的开发热潮在全球兴起，毛细管电泳技术（Capillary Electrophoresis, CE）作为一种新兴的研发和质控的分析技术也越来越受到各大生物制药公司的青睐和法规机构的重视。全球大部分生物制药公司均已使用毛细管电泳系统用于蛋白药物的研发及质量控制分析。从培养基优化、克隆筛选、配方稳定性研究和纯化过程监测，到蛋白表征、相关杂质检测、蛋白结构鉴定和蛋白质药物产品的质量控制，蛋白药物的各个环节都需要使用到毛细管电泳。例如蛋白的纯度测定，已经从SDS-PAGE转变为十二烷基硫酸钠-毛细管凝胶电泳（CE-SDS）方法；蛋白质的等电点测定，毛细管等电聚焦(CIEF)比传统胶条方法更为准确；糖蛋白药物的糖基异质性表征，毛细管电泳是高分辨率分析方法之一。在各国药典中，毛细管电泳技术用于蛋白药物的检测方法也不断丰富与发展。药典中最早出现其对蛋白药物检测方法是促红细胞生成素(EPO)的糖异构体测定。糖蛋白的异构体差异小，普通的分析方法很难将EPO中的多种异构体分离定量。欧洲药典和美国药典将毛细管电泳方法确定为EPO异构体分析的标准，解决EPO产品中各种糖基化异构体的分离和定量问题。此外，生长激素的相关杂质检测标准也采用了毛细管电泳的方法。对于单克隆抗体药物的分析，在2006年，由惠氏、安进、基因技术、礼来、辉瑞、强生及加拿大卫生署等十几个实验室对“CE-SDS方法对单抗药物纯度分析”进行了联合验证。他们对方法的稳定性、可靠性、准确性等多方面进行了研究和考察。研究结果表明CE-SDS方法比传统的SDS-PAGE更适合单抗药物的表征与质量控制，其结果的稳定可靠性要远远超过SDS-PAGE，建议各生物制药公司使用CE-SDS代替原有的SDS-PAGE作为研发与质量分析的平台。随后，上述生物制药公司及机构又针对“CIEF方法进行单抗药的等电点测定及电荷异质性分析”、“CZE方法快速分析单抗药的电荷异质性”，“毛细管电泳技术进行单抗药中的糖基分析”进行了多实验室联合验证，结果展现了CE技术用于单抗药质量控制的优势及可行性。美国药典于2013年发布了利妥昔和曲拓珠等单克隆抗体药物的纯度检测、等电点/电荷异质性分析和糖基分析采用毛细管电泳方法。在中国，中国食品药品检定研究院于2012年联合国内外生物制药机构对“CE-SDS方法对单抗药物纯度分析”进行了验证，确认了CE-SDS方法在分辨率、定量准确性及自动化程度等方面的优势，并指出CE可以对单抗非糖基化重链进行准确定量。基于以上工作以及毛细管电泳技术在单抗药分析中的强大优势，中国药典2015版的第三部中增加了CE技术，明确了CE是单克隆抗体药物大小变异体、电荷变异体、鉴别与一致性和糖基化修饰分析中的重要方法。随着CE技术在生物制药领域的快速发展，以及新的蛋白质药物的不断上市，将会有更多的CE方法出现在各国药典中。毛细管电泳技术在单克隆抗体药物分析中的应用（1）单克隆抗体药物的纯度及大小异质性分析SDS-PAGE方法对单抗药物进行纯度分析，在分辨率、定量准确性和自动化程度上，已经不能满足生物制药研发和质量控制的要求。CE-SDS方法基于蛋白分子量的差异分离，用于还原和非还原单抗药物的纯度分析，免去了复杂的人工操作、定量更加准确，具有更高的分辨率，在还原模式中可对非糖基化重链进行分离和准确定量。图1. CE-SDS对还原单克隆抗体药物的纯度分析[1]选用不同的毛细管长度，可以实现高分辨率模式和快速模式的纯度分析。高分辨模式的CE-SDS方法提供最高的分辨率，快速模式的CE-SDS方法提供更短的冲洗和分离时间，提高了分析的通量。CE-SDS结合激光诱导荧光检测器（CE-SDS-LIF），通过5-Tarma或FQ染料对蛋白进行标记，可以获得更高的灵敏度，可以检测到含量在0.01%的杂质碎片。此外，LIF检测器的使用，可以最小化基线波动，使积分和定量更加准确。（2）单克隆抗体药物等电点的测定和电荷异质性的分析单抗药物在结构上会发生糖基化、脱酰胺化、异构化、氧化等翻译后修饰，造成蛋白表面电荷的改变，引起单抗的电荷异质性。每个变异体具有不同的等电点。基于等电点分离的毛细管等电聚焦技术(cIEF)，可以对单抗药物的变异体进行高分辨率的分离和定量，可分离0.03个pI差异的变异体。方法使用等电点Marker制作校准曲线，对变异体的等电点进行准确的测定。是单抗药物等电点测定和电荷异质性分析的重要方法。图2. CIEF方法对单克隆抗体药物的等电点和电荷异质性分析[5]针对不同pI范围的蛋白样品，可以通过选用适当的两性电解质来实现高分辨率的分析。如对于大部分单抗，其pI值位于7-10之间，可使用pH 3-10范围的两性电解质；对于pI 在5-7范围内的蛋白样品，可使用pH 5-8的窄范围两性电解质；而对于pI 小于5的酸性蛋白，则可以使用反向聚焦和迁移模式，实现更好的分析。 （3）CZE方法对单克隆抗体药物电荷异质性的快速分析毛细管区带电泳（CZE）基于分析物电荷/体积的比进行分离，是毛细管电泳技术中最简单、快速的模式。由于单抗药物的各个变异体分子体积近乎相同，因此在CZE分离模式中，电荷变异体的分离取决于表面电荷的差异，与CIEF模式的变异体分离相一致。因此，CZE成为快速电荷异质性分析的平台方法被生物制药行业所使用。此外，由于CZE方法简单快速的特点，它也被用于单抗药的鉴别分析中。图3. 同一种CZE方法对23种单抗药物的电荷异质性分析[3]（4）单克隆抗体药物的糖基异质性分析单克隆抗体等糖蛋白药物中，糖基的种类和排列顺序会导致糖基异质性。单抗药物的糖基化修饰对其安全性和药效有着很大的影响。因此对糖基异质性的质量控制十分重要。毛细管电泳方法对糖基异质性分析的流程包括糖蛋白中糖基的释放、糖基的标记和毛细管电泳分离。磁珠辅助的糖基释放和标记，使得前处理可在1小时内完成，加快了前处理的时间。采用APTS作为荧光标记物，不仅可以通过增加电荷提高分离效率， 还通过LIF检测实现了高灵敏的糖基分析。毛细管电泳技术对糖基分析的优势在于分辨率高，速度快。不但可以区分出一个糖基的差别，相同分子量的糖基异构体也可以得到分离，整个分离过程可在5-20分钟内完成。图4. CE-LIF方法对单抗药糖基分析的电泳图毛细管电泳技术在重组蛋白类药物分析中的应用重组人促红细胞生成素（rhEPO）是高度糖基化的蛋白药物。糖基化的异质性导致了多种变异体的存在。采用CZE方法可对EPO的变异体进行分离和定量，该方法已经成为欧洲药典中EPO变异体分析的标准方法。此外，CIEF方法也可以实现对EPO中各个变异体的高分辨分离，不但可以获得与CZE方法相同的变异体数目和定量信息，还可以提供每个变异体的精确的等电点数值。在对不同来源的EPO产品与参考品的比较中，可使用等电点对变异体进行鉴定。图5. CZE方法对EPO变异体的分析重组人生长激素（rhGH）的纯度及异质性分析中，CZE方法分离度高、定量准确，也已为欧洲药典所采用。图6 CZE方法对rhGH的电荷异质性分析总结在蛋白药蓬勃发展的今天，毛细管电泳技术以其分辨率高、模式多等优势，在蛋白药研发和质控的过程中起到了不可或缺的作用，被越来越多的企业和监管机构所认可，用于蛋白药的纯度、等电点及电荷异质性、糖基等分析中。随着蛋白药物、细胞/基因治疗以及新型疫苗等生物制品的不断发展，毛细管电泳技术将会具有更大的应用空间，在蛋白、核酸及病毒颗粒等分析中，发挥它的优势，提高生物制品的质量控制标准。