微生物快速鉴定系统

欧洲顶级临床诊断实验室集团——斯耶莱柏集团(Synlab Group)在2009年12月5日表示，已开发出新的基于蛋白质组的微生物快速鉴定系统——MALDI Biotyper微生物鉴定系统——该系统将从2010年装备其旗下遍布欧洲的70余家诊断实验室。该鉴定系统由生命科学和分析仪器领域出色的领导者布鲁克• 道尔顿公司开发。　　研究员乌瑞科• 科尼普(Dr. Ulrich Knipp)博士说：“该检测系统的原理是：每种微生物都有自身独特的蛋白质组成，因而拥有独特的蛋白质指纹图谱。MALDI Biotyper高通量微生物鉴定系统通过MALDI-TOF质谱仪测得待测微生物的蛋白质指纹谱图，通过Biotyper软件对这些指纹谱图进行处理并和数据库中各种已知微生物的标准指纹图谱进行比对，从而完成对微生物的鉴定。”　　应用专家顾依杜• 马克斯(Dr. Guido Mix)博士介绍了MALDI Biotyper微生物鉴定系统的优点：Biotyper数据库中已经含有三千多种微生物的特征指纹谱，其中包括我国二零零九年三月正式颁布实施的食品卫生微生物检验2009国家标准 (GB/T 4789) 中规定检验的细菌，如沙门氏菌、大肠埃希氏菌、单增细胞增生李斯特氏菌、双歧杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、粪大肠菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、乳酸菌以及来自海产品的副溶血性弧菌和婴幼儿配方食品、乳品和乳制品及其原料中必检的阪崎肠杆菌等。　　有关布鲁克• 道尔顿公司的MALDI Biotyper微生物鉴定系统：　　MALDI Biotyper的工作原理：　　MALDI Biotyper高通量微生物鉴定系统拥有如下的优点：　　(1)操作简单、快速、通量高　　单个微生物菌落或其它生物材料经简单的样品前处理(仅需几分钟)后，使用MALDI-TOF质谱仪进行测定。所获得的质谱图可直接送到Biotyper数据库进行检索。这个简单而独特的工作流程可以满足绝大多数微生物的鉴定，而且不需要进行革兰氏染色、氧化酶试验或选择PCR引物。一个样品从获得单克隆开始，到样品处理、谱图采集和获得鉴定结果可以在几分钟内完成，操作简单、快速，通量高。　　(2)灵敏度高　　使用经久耐用且性能可靠的布鲁克• 道尔顿的MALDI-TOF系列仪器，可以实现高重复性的快速检测。由于仪器的高灵敏度，可以检测到低至100ng的细胞。如果采用已享盛名的布鲁克AnchorChip™ 技术，甚至25ng的样品就能满足需求。　　(3)准确度好　　MALDI-TOF获得的蛋白指纹图谱用作模式匹配，匹配分值用作鉴定结果的分级和归类。Biotyper软件对所得的图谱进行分析统一化，其复杂而精巧的校正和统计运算保证了鉴定的精确性。蛋白指纹主要集中在2-20kDa受到微生物生长环境和状态影响很小的持续高表达蛋白。强大的分析软件具有谱图校正功能。甚至偏离至5000ppm的质谱图都能够成功校正并鉴定。　　MALDI Biotyper高通量微生物鉴定系统拥有如下的创新性：　　(1) 优越、成熟的硬件技术。　　MALDI Biotyper高通量微生物鉴定系统是建立在MALDI-TOF质谱仪上的。尽管多年来国际、国内的众多研究人员都在尝试建立基于MALDI-TOF技术的微生物鉴定技术，但大多受限于MALDI-TOF质谱技术的有效应用。布鲁克公司的FLEX系列MALDI-TOF质谱仪历经十多年的开发已经非常的成熟，采用了很多专利技术，各项性能指标均很优越，公司并针对微生物检测和鉴定专门开发了专属的样品制备和测定系统，并做了大量认真、细致的研究工作，形成了目前这套准确度高，灵敏度高而且重复性非常好的微生物检测、鉴定系统。　　(2) 设计新颖的Biotyper软件。　　BioTyper软件是MALDI Biotyper高通量微生物鉴定系统的一个重要组成部分。这一软件与布鲁克的MALDI-TOF质谱仪的仪器控制和数据采集软件配套并且有机地结合在一起，使用了数据库服务器和客户端分离的模式，采用先进的算法，可以自动化地快速处理大量的数据，以达到高通量准确鉴定的目的。此外，软件的用户界面友好，使用方便。　　(3) 开放式的Biotyper微生物蛋白特征指纹图谱数据库系统。　　MALDI Biotyper高通量微生物鉴定系统的另一个重要组成部分是Biotyper微生　　物蛋白特征指纹图谱数据库系统。这一数据库系统采用开放式的设计，使用简单，占用资源少，使用服务器和客户端架构，既可使用专用的电脑服务器，也可以单机使用，方便、快捷地大批量地处理数据，无需专人维护。目前数据库中已经含有常见的近3290种微生物的特征指纹图谱，而且还在不断增加中。此外，用户可以根据自己的需要，轻松地添加所获得的新的微生物特征指纹图谱，并用于日常检测、鉴定工作中。　　(4) 大量实际应用经验积累　　MALDI Biotyper高通量微生物鉴定系统的开发过程中得到了诸如德国微生物和细胞培养收集中心、美国农业部农业研究服务中心食品微生物学部及其他众多欧美政府部门和大学、医院、研究所等科研单位的支持，在多方合作的努力下，积累了大量实际应用经验，并且这一系统已经在这些地方得到了充分地应用。专家们一致认为MALDI Biotyper具有快速简便的工作流程和强大可靠的数据处理能力，是微生物鉴别与分类中的最新技术。　　(5)在我国食品安全等领域中的应用　　近几年相继发生的几起食品安全事件，引起人们对食品安全问题的广泛关注。我国监管部门也越发加强了对食品安全问题的重视。如2008年12月29日发布、2009年4月1日开始实施的新国标GB/T 8538-2008《饮用天然矿泉水检验方法》，就提高了对饮用水的检测要求，要求对饮用天然矿泉水及其灌装水进行粪链球菌、铜绿假单胞菌和产气荚膜梭菌等3项微生物指标的检验。而Biotyper数据库中已经有这些菌的标准图谱，可以很方便地进行这些菌的检测，可以用于自来水和其它饮用水中的微生物鉴定。

近日，生物梅里埃宣布推出首款带有CE标志的数据库及试剂盒，用于在MALDI-TOF系统中分枝杆菌、诺卡氏菌及霉菌的鉴定。这个解决方案新增了297个包括结核分枝杆菌(TB)的新菌种、45个最常见的非结核分支杆菌(NTM)菌种及48个临床最重要的霉菌菌种，进而大大增强了VITEK质谱系统的性能。VITEK质谱系统全新数据库及试剂盒目前在通过CE认证的国家均已上市销售。　　分枝杆菌、诺卡氏菌及霉菌是非常难以鉴定的微生物，其适度的生长均需要在特殊条件下培养数天乃至数周，随后还需要用快速、可靠的方法进行物种鉴定。升级后的VITEK质谱系统现在即可提供简单、快速、可靠的病原微生物鉴定方法，为临床医生提供可靠结果，从而治疗因这些微生物导致的传染性疾病，例如结核病、肺部及骨感染以及其他一些列器官感染。　　“生物梅里埃五十多年来一直致力于开发创新性诊断方法，用以对抗传染性疾病。我们以推出快速而准确的微生物鉴定解决方案从而提高了临床应用价值为荣，”生物梅里埃临床部门副总裁Fran?ois Lacoste如是说道，“为VITEK质谱系统增加的三种重要病原微生物的鉴定能力增强了我们的诊断解决方案，为医务人员带来了方便，最终为患者带来了福音。”　　以专利方法为基础，VITEK MS分枝杆菌、诺卡氏菌及霉菌试剂盒可简单、快速、安全的鉴定这些生物体。扩大后的VITEK MS数据库目前可以在几分钟内鉴定1046种菌群，代表了15172种细菌、酵母菌及霉菌。这个高度自动化质谱系统使用简单、方便的试剂盒，为实验室专家提供非常可靠的试验结果。对于选择使用质谱系统进行微生物鉴定的微生物学家来说，生物梅里埃提供完全一体化的解决方案，包括应用VITEK MS的鉴定及应用VITEK 2的抗生素药敏试验，具有强大的病原微生物信息库及优良的工作流程管理。

19世纪早期发展起来的自动化工业一方面是为了提高生产性能，降低成本，另一方面是为了工人的安全利益考虑。信息技术使自动化得到快速发展，自动化能够减轻人们繁琐的体力劳动和重复性劳动，还能够给企业在不增加员工的情况下提高了生产率，同时企业降低了运营成本，提高了产品利用率，提高了生产效率，操作还具有可靠性。大家虽然认识到自动化有许多好处，但自动化也面临诸多现实问题。目前自动化几乎在所有的行业中都得到了有效实施应用，包括医学实验室。全实验室自动化临床标本的处理TLA（Total Lab Automation）可以提高效率和样本可追溯性。实验室收到样本后，立即对所有样本进行连续处理。根据样本类型和要求的分析，自动选择并标记适用的培养基。根据划线模式，利用标定后的接种环对样本进行接种。接种的培养基通过传送带迅速转移到培养箱中。这允许跳过样本的批处理以及手动工作列表的创建。TLA还通过大幅减少标本的处理来提高技术人员的安全水平，因为培养皿的检查是通过数字图像在屏幕上进行的。培养基平板的培养和成像通过使用TLA，接种的培养基可以及时地从处理区转移到培养箱。琼脂平板在最佳生长条件、稳定的温度和适宜的环境下培养，因为培养箱的门在整个培养过程中始终保持关闭。微生物生长通过在预定时间点拍摄的高分辨率数字图像进行监测。这使得能够更快速地检测微生物生长，同时也提高了缓慢生长病原体的复壮。此外，TLA使用一种软件，可以在更高的放大率下查看数字图像，从而促进对菌落形态的进一步判断和混合培养物的检测。数字图像由训练有素的技术人员进行解读，与传统的诊断工作相比，情况完全不同，因为细菌菌落在屏幕上呈现形态和手工操作判断非常不同。TLA最终建立了一个图像库，可以用于对比校对，也可以在与传染病专家讨论时提供帮助并对个别患者进行分析。培养基平板的检验为了最大限度地利用成像，应在不同的时间点拍摄数字图像，同时观察最早出现的微生物，以便尽早检测较早出现的微生物生长情况（Figure1）。因此，与常规检查相比，病原体的鉴定和抗生素耐药性检测（AST）可以更早地获得，因此缩短了周转时间（TAT）。使用TLA，将每个接种的培养皿培养一段时间，以便在白天和晚上都可以进行处理。这种处理效率最高，对TAT产生了有益的影响，可以更好地管理工作任务和工作流程。（Figure 2）使用数字图像对培养基平板进行评估判断和解读仍由实验技术人员执行，他们确定需要分离哪些目标菌落，并对其进行进一步处理，以进行鉴定和AST。当前版本的TLA无法取代这些人工操作。然而，市场上新推出的其他自动化系统（例如Copan Colibri™ ), 可以通过MALDI-TOF和标准化接种物制备目标微生物鉴定（ID）以及AST（Figure 3）。ID和AST结果也必须由熟练的技术人员进行解读，这需要在人员配备方面进行充分考虑。为了匹配实验室工作量与诊断活动水平，TLA允许在任何时候跟踪整个诊断路径中的所有样本。TLA还提供了评估流程和团队效率的不同指标，以及对患者检测结果的其他解读，包括抗生素耐药性的趋势分析。实施和应用临床微生物学实验室如今面临着许多不同的挑战，包括需要：（1）提高效率（即提供更具成本效益的诊断）；（2）提供早期结果（即缩短TAT）；（3）遵守要求越来越高的认证要求（即提供可追溯性和文件，以评估整个诊断过程的质量）；（4）应对越来越多的耐多药生物带来的挑战（即快速提供更全面的AST，但在需要时）。大多数这样的挑战都可以通过TLA得到显著解决。然而，TLA的成功实施需要：（1）传统工作流程的重大变化；（2）强大的领导技能，以及项目所有合作者的团队合作；（3）在整个实验室转型期内技术人员的个性化支持。减少临床样本周转时间在过去20年中，医疗行业投入了大量资源来开发准确和快速的检测方法，以减少临床医学中的样本周转时间（TAT）。随着抗生素耐药性的不断增加，需要快速地给出应对策略，以便对患者能够及时治疗。在全实验室自动化（TLA）出现之前，主要用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定细菌、分枝杆菌、酵母和霉菌，目前该方法取代了常规的生物化学实验检测方法。与用于微生物鉴定的常规方法或分子水平分析相比，MALDI-TOF-MS具有以下三个优点：（1）周转时间快（2）样本量要求低（3）试剂成本适中。使用MALDI-TOF-MS能够准确、快速地鉴定微生物，有助于快速提供治疗方案，特别是意外感染了病原体时，该方法特别有效。因此，这项技术使抗菌治疗、感染预防和控制措施能够得到有效的实施（Figure 4A/B）。纸片扩散试验实现检测自动化全实验室自动化（TLA）在许多领域得到推广应用，抗生素耐药性检测全自动化解决方案的实施，是全实验室自动化成功案例之一。在一项研究中，Copan为自动纸片扩散AST开发了一种新模块，包括一个可容纳50个抗生素药筒的转盘。开发这个新模块的明确目标是，通过增加第二条传送带，最大限度地减少AST线上的工作流程瓶颈。这个新的全集成自动化系统能够实现：可以使用至少四个不同的菌落制备接种悬浮液，以筛选不同的抗性模式；在特定平板的整个表面上自动接种细菌细胞悬浮液；根据预设置的面板分配抗生素盘；将培养基运输至培养箱；在设置的时间点获取平板的高质量数字化图像；最后获得并解读所有受试抗生素的抑制圈直径大小。通过纸片扩散来评估AST全自动解决方案的准确性时，需要遵循的基本规则可以总结为两点：（1）评估这种新方法检测最重要的耐药机制，应包括具有代表性的非重复临床菌株数量，以及这些菌株对不同类别的抗生素表现出耐药模式；（2）为了计算耐药的百分比误差，分析中还应包括大量非重复敏感临床菌株。革兰氏阴性菌常规AST在过去十年中，研究表明，厌氧菌中抗生素耐药性稳步增加了。面对这样的现状，对厌氧菌进行常规耐药性试验十分必要。作为全自动纸片扩散的补充，通过与目前的常规方法ATB ANA测试法（BioMérieux）进行比较，在大量临床相关厌氧菌株上测试了Thermo Scientific™ Sensititre™ 厌氧菌MIC平板的准确性，两种方法之间的一致性达到95%。通过整合靶向治疗中使用的最新分子，为多重抗性革兰氏阴性菌设计了一种新的平板。该平板由Thermo Scientific™ 制造并使用ATCC参考菌株进行验证。目前只要AST纸片扩散检测到设定的抗性模式，这个平板就可以进行下一步测试。正如自动AST测试所研究的那样，这一设计能够通过系统地针对可疑菌株，以合理的成本有效监测抗生素耐药性。Sensitre敏感性系统采用一种固体平板设计方法。该方法可以测试定性（敏感或耐药）和定量最小抑制浓度（MIC）试验。人工制备菌株悬浮液，并使用Sensitre Autoinvocator/AIM自动接种平板。固体平板上添加了为测试的微生物选择的连续稀释的抗菌剂。接种培养后，使用Sensitire手动查看器读取结果。通过浑浊或底部细胞沉积来测试细菌生长情况。最小抑制浓度（MIC）是指抑菌试验中可见细菌生长的最低药物浓度。在过去的几十年里，多重耐药的革兰氏阴性细菌感染已经成为医学和全球卫生领域关注的主要领域之一。为了优化治疗方案，并应对不断增加的产碳青霉烯酶的革兰氏阴性细菌，使用最有效药物的添加使用最小抑制浓度（MIC）已变得至关重要。通过对多重耐药（MDR）菌株进行靶向AST测定，同时结合治疗药物监测（TDM），可以得到最有效的治疗方法。由于琼脂扩散不能提供MIC，如在培养MDR菌株或厌氧菌时，Sensititre是对全自动AST纸片扩散的补充。结论全实验室自动化（TLA）现已被证明能够有效进行临床微生物学检测，可以克服微生物实验室培养检测所面临的多样性和复杂性。能够实现对各种指标（临床应用、检测效率、可追溯性、质量管理和TAT）进行监测，通过纸片扩散能够实现AST的完全自动化。人工智能（AI）的实施不仅可以快速识别细菌生长（检测），还可以区分细菌形态（分割）和统计相应的菌落（计数），这将进一步增强微生物检测工作流程，并能够确保试验的可重复和可预测。现在需要进行仔细的验证研究，以便使用人工智能自动处理阴性培养物，并在无需人工干预的情况下自动获取试验结果。全文完信息来源：Cherkaoui A, Schrenzel J. Total Laboratory Automation for Rapid Detection and Identification of Microorganisms and Their Antimicrobial Resistance Profiles. Front Cell Infect Microbiol. 2022 Feb 3 12:807668. doi: 10.3389/fcimb.2022.807668.文献来源 | 本文由中科院上海生命科学信息中心与上海曼森生物合作供稿内容审核 | 曼森生物郝玉有排版编辑 | 曼森生物刘娟娟