激光片层扫描系统

激光扫描共聚焦显微镜还能这么用！　　众所周知，激光共聚焦显微镜主要的应用方向在观察活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，而在石笋这样的样品观察上使用激光扫描共聚焦显微镜，可以说脑洞大开了！让我们来看看原文，从Nikon A1激光扫描共聚焦显微镜使用者的角度看看，怎么把这个工具用活了！　　激光扫描共聚焦显微镜在古气候纹层学的应用　　第一作者：赵景耀　通讯作者：程　海　　1984年第一台商业化的激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称 LSCM）出现，随之共聚焦显微镜技术成为了一个热点，并广泛应用在国内外生物和工业检测领域。现今，我们将LSCM首次应用于国内古气候纹层学研究。纹层学一直是古气候研究重要内容，特别是荧光微层在很多古气候载体中是重要的年代标尺和气候指标。2000年，Ribes等首次将LSCM应用于石笋荧光微层研究，发现LSCM分辨率可达１μｍ，因此，可适用于各种不同厚度的石笋年纹层；2008年，Orland等将LSCM与离子探针采样结合，首次发现了石笋δ18O的季节性信号，并表示以色列Soreq Cave单层δ18O季节波动可达2.15‰；2010年，Dasgupta等通过LSCM识别石笋纹层中的碎屑和粘土层，据此重建了美国明尼苏达州过去3000年极端暴雨事件，发现20世纪全球升温以来，其暴雨频率明显增加；2015年，Wendt利用LSCM，在巴西TBV Cave石笋纹层中发现了罕见的“双纹层”，且均出现在高生长速率的Heinrich事件期间，认为这与Heinrich期间，Intertropical Convergence Zone（ITCZ）南支南移所导致一年内存在2个雨季有关；2015年，Orland等再次将LSCM与离子探针技术应用于中国苦栗树洞石笋研究，发现全新世和B?lling-Aller?d暖期的夏季降水比例明显多于Younger Dryas时期。而目前，国内主要依赖于普通透射光和荧光显微镜，这一定程度上限制了国内古气候学研究。笔者在西安交通大学机械制造系统工程生物制造中心，利用购置的LSCM组件（图1a），观察石笋“年纹层”和砗磲“天纹层”，取得初步认识，以下分别就LSCM及其在古气候荧光微层方面的应用及注意事项作一简介。　　图1　激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）组件（a）及其原理（b）　　1.倒置荧光显微镜（Inverted fluorescence microscope）；2.荧光探测器（Flurescence detector）；3.激光发生器（Laser generator）；4.LSCM总控制器（Main controller）；5.扫描头（Head of laser scanner）；6.明场及电动载物台开关（Switch of bright-field microscopy and electric stage）；7.．荧光光源开关（Switch of fluorescent source）；8.电动载物台（Electric stage）；9.LSCM连接电脑（Computer and Monitor）　　LSCM以激光为点光源，由照明针孔与探测针孔对被探测点的共轭关系（图1b），实现对被探测点所在焦面的逐点激发，逐点扫描，该技术称为共聚焦。与普通荧光显微镜一次性照明整个视野不同，LSCM通过逐点扫描探测，呈现标本荧光层的2维或3维图像（图2），因此其对不同焦点和焦面的辨析能力，是普通荧光显微镜所不能达到的。其中，图2a中3D切片z轴步进间距（即焦面间距）为3μｍ，当前仪器上限25nm（仪器型号：Nikon A1）。在LSCM标本纹层成像过程中，放置于探测器前的探测针孔（Pinhole）（图1b）起着关键作用，有效地阻挡了不同焦点带来的杂散光，只有被探测点所发射的荧光透过Pinhole，到达探测器形成图像，这对图像对比度和分辨率有重要影响（图2）。而且LSCM采用光电倍增技术，可将微弱荧光信号进一步放大。综上，利用LSCM可以真正地实现10μｍ级荧光纹层的清晰辨别，其分辨率和辨识度是普通荧光显微镜所不能实现的，在此基础我们可以观察并辨别10μｍ左右石笋“年纹层”（图2d）和3~5μｍ级别砗磲“天纹层”（图2e）。　　图2　石笋荧光层3D切片拟合（a）、石笋荧光“年纹层”（b、c和d）和砗磲荧光“天纹层”（e）　　所有图像在1024扫描分辨率下，利用波长为488-nm的蓝色激光作为激发光源激发，然后用荧光滤光片滤选发射波长为505~539nm绿色发射光，最终被检测器探测并扫描成像；图片（a）由LSCM连续拍摄31层平行荧光焦面拟合而成，3μm／层；石笋样品（a）和（c）取自湖北省犀牛洞，（b）取自南京葫芦洞，（d）取自吉林省琉璃洞；（e）砗磲取自中国南沙群岛永暑礁　　不同于普通光学显微镜，通过制作极薄的显微镜[url=http://www.gengxu.cn]滤光片[/url]（≤１mm）实现对于杂散光或荧光焦面的控制。LSCM装配倒置荧光显微镜直接对古气候标本切面观察，源于LSCM对不同焦面荧光信号的精准解析和辨别能力，对于石笋和砗磲等古气候标本，无需制作显微镜薄片，只需将样品切面抛光磨平，即可实现对抛光表面荧光微层和透光微层定焦高分辨率扫描。LSCM极大地简化标本处理，不仅能够更好地节约和保护标本，且能和其他分析（如稳定同位素分析）在同一样品上进行，有利于精细对照，对于古气候研究有重要意义。例如，最近Li等在其他方法精确定年困难的情况下，利用LSCM方法精确确定了近百年石花洞的石笋样品年代序列；对著名的南京葫芦洞样品的初步工作显示，将能够重建上个冰期精细到年的时间序列及气候变化的变率（图2b），而又不破坏极其珍贵的样品。　　但是由于LSCM以激光作为光源，在镜下观察过程中发现，根据物镜倍数（10×、20×、40×、60×和100×）不同，导致激光聚光强度不同，会出现不同程度的荧光猝灭，对于常用倍数10×和20×，荧光猝灭微弱，肉眼无法识别，可忽略。但是在60×油镜及以上倍数，荧光猝灭快速，因此在使用过程中，要注意调焦与拍摄时间的平衡。另外，计算机对焦过程是纳米级对焦，在标本前期处理过程中，保证样品观察面平整，是快捷对焦、自动扫描和拼接大图的工作基础。对于目前使用的型号Nikon A1，由于LSCM电动载物台承重和规格限制，以及明场聚光器位置限制（图1a），要求古气候标本观察面≤６cm×６cm，厚度≤５cm，但可根据需要选择不同型号的载物台。最后，由于各种LSCM在许多研究机构和医学院都具备，且使用费用不高，因此进行该研究不必购置新设备。

[url=http://www.f-lab.cn/microscopes-system/dplsm.html][b]差分偏光激光扫描显微镜[/b][/url]differential polarization laser-scanning microscope (DPLSM)具有[b]扫描光学显微镜[/b]和[b]分光偏振计[/b]的双重优点，可提供逐像素地实施的生物样本的各向异性数据，在记录生物组织图像强度的同时，能够实时地提供高精度的生物样品的各向异性组织的逐个像素的数据。差分偏光激光扫描显微镜采用模块化设计，可以直接安装到用户现有的激光扫描显微镜上，不用担心改变原来的光路和电子。我公司提供方便安装的差分偏光激光扫描显微镜DPLSM模块,可直接安装到激光扫描显微镜上，不需要改变电路和光路就可使用差分偏光激光扫描显微镜DPLSM功能。差分偏光激光扫描显微镜：[url]http://www.f-lab.cn/microscopes-system/dplsm.html[/url]

激光共聚焦扫描显微镜简介一、 激光共聚焦显微镜的基本组成激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。激光共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。激光共聚焦显微镜主要有四部分组成：1、显微镜光学系统。2、扫描装置。3、激光光源。4、检测系统。整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。1.1 显微镜光学系统　　显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成象质量。显微镜光路以无限远光学系统可方便地在其中插人光学选件而不影响成象质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径平场复消色 差物镜，有利于荧光的采集和成象的清晰。物镜组的转换，滤色片组的选取，载物台的移动调节，焦平面的记忆锁定都应由计算机自动控制。1.2 扫描装置　　LSCM使用的扫描装置在生物领域一般为镜扫描。由于转镜只需偏转很小角度就能涉及很大的扫描范围，图象采集速度大大提高，512×512画面每秒可达4帧以上，有利于那些寿命短的离子作荧光测定。扫描系统的工作程序由计算机自动控制。1.3 激光光源　　LSCM使用的激光光源有单激光和多激光系统。多激光器系统在可见光范围使用多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光，氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光，氦氖红激光器发射波长为633nm的红光，新的405nm半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线，但是小巧便宜而且维护简单。1.4 检测系统　　LSCM为多通道荧光采集系统，一般有三个荧光通道和一个透射光通道，能升级到四个荧光通道，可对物体进行多谱线激光激发，样品发射荧光的探测器为感光灵敏度高的光电倍增管PMT，配有高速12位A/D转换器，可以做光子计数。PMT前设置针孔，由计算机软件调节针孔大小，光路中设有能自动切换的滤色片组，满足不同测量的需要,也有通过光栅或棱镜分光后进行光谱扫描功能的设置。二、激光共聚焦显微镜的特点以及在生物领域的应用传统光学显微镜相比，激光共聚焦显微镜具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点，在对生物样品的观察中，激光共聚焦显微镜有如下优越性：1、对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描，可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。2、 可以得到比普通荧光显微镜更高对比度、高解析度图象、同时具有高灵敏度、杰出样品保护。3、***图象的获得，如7 维图象(XYZaλIt): xyt 、xzt 和xt 扫描,时间序列扫描旋转扫描、区域扫描、光谱扫描、同时方便进行图像处理。 4、细胞内离子荧光标记，单标记或多标记，检测细胞内如PH和钠、钙、镁等离子浓度的比率测定及动态变化。5、荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质，膜标记、免疫物质、免疫反应、受体或配体，核酸等观察；可以在同一张样品上进行同时多重物质标记，同时观察； 6、对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图像可及时输出或长期储存。 由于共聚焦显微镜的以上优点，激光共聚焦显微镜在以下研究领域中应用较为广泛：1、细胞生物学：如：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡机制；各种细胞器、结构性蛋白、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞特异性结构的含量、组分及分布进行定量分析；DNA、RNA含量、利用特定的抗体对紫外线引起的DNA损伤进行观察和定量；分析正常细胞和癌细胞细胞骨架与核改变之间的关系；细胞黏附行为等 2、生物化学：如：酶、核酸、受体分析、荧光原位杂交、杂色体基因定位等，利用共聚焦技术可以取代传统的核酸印迹染交等技术，进行基因的表达检测，使基因的转录、翻译等检测变的更加简单、准确。3、药理学：如：药物对细胞的作用及其动力学；药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 4、生理学、发育生物学：如：膜受体、离子通道、离子含量、分布、动态；动物发育以及胚胎的形成，骨髓干细胞的分化行为；细胞膜电位的测量.荧光漂白恢复（FRAP）、荧光漂白丢失（FLIP）的测量等。 5、遗传学和组胚学：如：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断； 6、神经生物学：如：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递； 7、微生物学和寄生虫学：如：细菌、寄生虫形态结构； 8、病理学及病理学临床应用：如：活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断； 9、免疫学、环境医学和营养学。如：免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位，细胞膜受体或抗原的分布,微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位；对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达，荧光能量共转移（FRET）。