落射荧光显微系统

[ 产品简介 ]蔡司推出的全新Lightsheet 7激光片层扫描显微系统，助您高效便捷地实现活体和透明化样品的多视角成像。全新设计的物镜能够精确匹配透明化样品的折射率，从厘米大尺寸的样品，到多维时空的活体成像，无论是观察长达数天的生物发育过程，还是捕捉快速运动的血流心跳，都能助您游刃有余完成。同时，无需频繁更换物镜和样品仓,“傻瓜式”上样为您解放双手，提升效率，在简单调焦中实现理想光切。无需再为制备样品而烦恼，无需再为繁琐操作而困扰，让蔡司的Lightsheet 7系统，以简便轻松的方式带您洞悉生物世界。[ 产品特点 ]&bull 成像更深、速度更快、极低的光损伤&bull 适用于不同透明化制样&bull 全新样品定位方法创建多视角 (Multiview）数据，灵活的观察视野&bull 高灵敏度，高信噪比&bull 专利扫描技术获得高质量图像[ 应用领域 ]&bull 发育生物学：胚胎发育、器官发育等动态过程快速成像&bull 大型固定样品结构成像&bull 不同透明化样品成像&bull 三维细胞培养&bull 植物学等生命科学领域研究拟南芥花的发育图像-样品：图片由捷克共和国布尔诺市马萨里克大学中欧技术研究院（CEITEC）的S. Valuchova、P. Mikulkova和K. Riha提供。用改良的iDISCO 方法对Thy1-EGFP 标记的鼠脑进行透明化处理，在高折射率溶液（RI=1.56）中用Fluar 2.5x/0.12 物镜进行成像。样品由美国加州大学欧文分校的S. Gandhi 和TranslucenceBiosystems 公司提供。神经元类器官成像，像素尺寸：222 x 222 x 567 nm。图像体积：1.66 x 0.66 x 1.6 mm。样品由奥地利维也纳市分子生物技术研究所的D. Reumann 和J. Knoblich 提供。

荧光和荧光寿命分子包含多个单能态S0、S1、S2…和三重态T1…，每个能态都包含多个精细的能级。正常情况下，大部分电子处在*低能态即基态S0 的*低能级上，当分子被光束照射，会吸收光子能量，电子被激发到更高的能态S1 或S2 上，在S2 能态上的电子只能存在很短暂的时间，便会通过内转换过程跃迁到S1 上，而S1 能态上的电子亦会在极短时间内跃迁到S1 的*低能级上，而这些电子会存在一段时间后通过震荡弛豫辐射跃迁到基态，这个过程会释放一个光子，即荧光。此外，亦会有电子跃迁至三重态T1 上，再由T1 跃迁至基态，我们称之为磷光。荧光特性研究荧光特性时，主要在以下几方面进行分析：激发光谱，发射光谱、荧光强度、偏振荧光、荧光发光量子产率、荧光寿命等。其中荧光寿命（Fluorescence Lifetime）是指荧光分子在激发态上存在的平均时间（纳秒量级）。荧光寿命测试荧光寿命一般在几纳秒至几百纳秒之间，如今主要有两类测试方法：时域测量和频域测量时间稳定性实验测试曲线：1 时域测量由一束窄脉冲将荧光分子激发至较高能态S1，接着测量荧光的发射几率随时间的变化。其中目前广泛应用的是时间相关单光子计数，即TCSPC(Time Correlated Single Photon Counting)时间相关单光子计数(TCSPC) 实现了从百ps-ns-us 的瞬态测试，此方法对数据的获取完全依赖快速探测器和高速电路。用统计的方法计算样品受激后发出的*一个( 也是唯一的一个) 光子与激发光之间的时间差，也就是下图的START( 激发时刻) 与STOP( 发光时刻) 的时间差。由于对于Stop 信号的要求，所以TCSPC 一般需要高重复频率的光源作为激发源，其重复至少要在100KHz 以上，多数的光源都会达到MHz 量级；同时，在一般情况下还要对Stop 信号做数量上的控制，做到尽量满足在一个激发周期内，样品产生且只产生一个光子的有效荧光信号，避免光子对的出现。2 频域测量对连续激发光进行振幅调制后，分子发出的荧光强度也会受到振幅调制，两个调制信号之间存在与荧光寿命相关的相位差，因此可以测量该相位差计算荧光寿命。 左图为正弦调制激发光（绿色）频域显示，发射光信号（红色）相应的相位变化频域显示。右图为对应不同寿命的调制和相位的频域显示。TM- 调制寿命，TP- 相位寿命。[1]显微荧光寿命成像技术（FLIM）显微荧光寿命成像技术（Fluorescence Lifetime ImagingMicroscopy，FLIM）是一种在显微尺度下展现荧光寿命空间分布的技术，由于其不受样品浓度影响，具有其他荧光成像技术无法代替的优异性能，目前在生物医学工程、光电半导体材料等领域是一种重要的表征测量手段。FLIM 一般分为宽场FLIM 和激光扫描FLIM。宽场FLIM（Wide Field FLIM,WFM）该技术是用平行光照明并由物镜聚焦样品获得荧光信号，再由一宽场相机采集荧光成像。宽场FLIM 常用于快速获取大面积样品成像。时域或是频域寿命采集都可以应用在宽场成像FLIM 上。宽场FLIM 有更高帧率和低损伤的优势。2 激光扫描FLIM（Laser Scanning FLIM,LSM）激光扫描FLIM 是针对选定区域内的样品逐点获取其荧光衰减曲线，再经过拟合*终合成荧光寿命图像。相比宽场FLIM，其在空间分辨率、信噪比方面有更大的优势。扫描方式有两种：一种是固定样品，移动激光进行扫描，一种是固定激光，电动位移台带动样品移动进行扫描。FLIM 应用材料科学领域宽禁带半导体如GaN、SiC 等体系的少子寿命mapping 测量量子点如CdSe@ZnS 等用作荧光寿命成像显微镜探针钙钛矿电池/LED 薄膜的组分分析、缺陷检测铜铟镓硒CIGS，铜锌锡硫CZTS 薄膜太阳能电池的组分、缺陷检测镧系上转换纳米颗粒GaAs 或GaAsP 量子阱的载流子扩散研究生命科学领域细胞体自身荧光寿命分析自身荧光相对荧光标记的有效区分活细胞内水介质的PH 值测量局部氧气浓度测量具有相同频谱性质的不同荧光标记的区分活细胞内钙浓度测量时间分辨共振能量转移（FRET）：纳米级尺度上的远差测量，环境敏感的FRET 探针定量测量代谢成像：NAD(P)H 和FAD 胞质体的荧光寿命成像OmniFluo-FLIM系列显微荧光寿命成像系统应用案例1 用荧光分子对海拉细胞进行染色用荧光分子转子Bodipy-C12 对海拉细胞（宫颈癌细胞的一种） 进行染色。(a) 显微荧光寿命成像图，寿命范围1ns（蓝色）到2.5ns（红色）；(b) 荧光寿命直方图，脂肪滴的短寿命约在1.6ns 附近，细胞中其他位置寿命较长，在1.8ns 附近。用荧光分子转子的时间分辨测量*大的好处在于荧光寿命具备足够清晰的标签特性，且与荧光团的浓度无关。[2]2 金属修饰荧光金属修饰荧光：(a) 荧光寿命是荧光团到金表面距离的函数；(b) 用绿色荧光蛋白（GFP）标记乳腺腺癌细胞的细胞膜的共聚焦xz 横截面，垂直比例尺：5 m；(c) b 图的FLIM 图，金表面附近的GFP 荧光寿命缩短。[2]3 钙钛矿太阳能电池下图研究中，展示了一种动态热风（DHA）制备工艺来控制全无机PSC 的薄膜形态和稳定性，该工艺不含有常规的有害反溶剂，可以在大气环境中制备。同时，钙钛矿掺有钡（Ba2+） 碱金属离子（BaI2:CsPbI2Br）。这种DHA 方法有助于形成均匀的晶粒并控制结晶，从而形成稳定的全无机PSC。从而在环境条件下形成完整的黑色相。经过DHA处理的钙钛矿光伏器件，在0.09cm小面积下，效率为14.85%，在1x1cm的大面积下，具有13.78%的*高效率。DHA方法制备的器件在300h后仍然保持初始效率的92%。4 MQWs 多量子阱研究在(a) 蓝宝石和(b) GaN 上生长的MQWs 的共焦PL mapping 图像。具有较小尺寸的发光团的*高密度是观察到在GaN 上生长的MQWs。在(c) 蓝宝石和(d)GaN 上生长的MQWs 的共焦TRPL mapping 图。仅对于在GaN 上生长的MQWs，强的PL 强度区域与较长PL 衰减时间的区域很好地匹配。在(e) 蓝宝石和(f)GaN 上生长的MQWs 在A 点和B 点测量的局部PL 衰减曲线，均标记在图中。对于在GaN 上生长的MQWs，点A 和B 之间的PL 衰减时间差更高。OmniFluo-FLIM系列显微荧光寿命成像系统参数配置北京卓立汉光仪器有限公司提供的显微荧光寿命成像系统是基于显微和时间相关单光子计数技术，配合高精度位移台得到微观样品表面各空间分布点的荧光衰减曲线，再经过用数据拟合，得到样品表面发光寿命表征的影像。是光电半导体材料、荧光标记常用荧光分子等类似荧光寿命大多分布在纳秒、几十、几百纳秒尺度的物质的不二选择。参数指标：系统性能指标光谱扫描范围200-900nm*小时间分辨率16ps荧光寿命测量范围500ps-1μs@ 皮秒脉冲激光器空间分辨率≤1μm@100X 物镜@405nm 皮秒脉冲激光器荧光寿命检测IRF≤2ns配置参数激发源及匹配光谱范围（光源参数基于50MHz 重复频率）375nm 皮秒脉冲激光器，脉宽：30ps，平均功率1.5mW，荧光波段：400-850nm405nm 皮秒脉冲激光器，脉宽：25ps，平均功率2.5mW，荧光波段：430-920nm450nm 皮秒脉冲激光器，脉宽：50ps，平均功率1.9mW，荧光波段：485-950nm488nm 皮秒脉冲激光器，脉宽：70ps，平均功率1.3mW，荧光波段：500-950nm510nm 皮秒脉冲激光器，脉宽：75ps，平均功率1.1mW，荧光波段：535-950nm635nm 皮秒脉冲激光器，脉宽：65ps，平均功率4.3mW，荧光波段：670-950nm660nm 皮秒脉冲激光器，脉宽：60ps，平均功率1.9mW，荧光波段：690-950nm670nm 皮秒脉冲激光器，脉宽：40ps，平均功率0.8mW，荧光波段：700-950nm科研级正置显微镜落射明暗场卤素灯照明，12V，100W5 孔物镜转盘，标配明场用物镜：10×，50×，100×监视CCD：高清彩色CMOS 摄像头，像元尺寸：3.6μm*3.6μm，有效像素：1280H*1024V，扫描方式：逐行，快门方式：电子快门电动位移台高精度电动XY 样品台，行程：75*50mm（120*80mm 可选），*小步进：50nm，重复定位精度：＜ 1μm光谱仪320mm 焦距影像校正单色仪，双入口、狭缝出口、CCD 出口，配置三块68×68mm 大面积光栅，波长准确度：±0.1nm，波长重复性：±0.01nm，扫描步距：0.0025nm，焦面尺寸：30mm(w)×14mm(h)，狭缝缝宽：0.01-3mm 连续电动可调探测器：制冷型紫外可见光电倍增管，光谱范围：185-900nm（标配，可扩展）光谱CCD（可扩展PLmapping）低噪音科学级光谱CCD（LDC-DD），芯片格式：2000x256，像元尺寸：15μm*15μm, 探测面：30mm*3.8mm，背照式深耗尽芯片，低暗电流，*低制冷温度-60℃ @25℃环境温度，风冷，*高量子效率值95%时间相关单光子计数器（TCSPC）时间分辨率：16/32/64/128/256/512/1024ps……33.55μs，死时间＜ 10ns，*高65535 个直方图时间窗口，瞬时饱和计数率：100Mcps，支持稳态光谱测试；OmniFluo-FM 荧光寿命成像专用软件控制功能：控制样品平移台移动，通过显微镜的明场光学像定位到合适区域，框选扫描区域进行扫描，逐点获得荧光衰减曲线，实时生成荧光图像等数据处理功能：自动对扫描获得的FLIM 数据，逐点进行多组分荧光寿命拟合（组分数小于等于4），对逐点拟合获得的荧光强度、荧光寿命等信息生成伪彩色图像显示图像处理功能：直方图、色表、等高线、截线分析、3D 显示等操作电脑品牌操作电脑，Windows 10 操作系统 FLIM 软件界面控制测试界面测试软件的界面遵循“All In One”的简洁设计思路，用户可在下图所示的控制界面中完成采集数据的所有步骤：包括控制样品平移台移动，通过显微镜的明场光学像定位到合适区域，框选扫描区域进行扫描，逐点获得荧光衰减曲线，实时生成荧光图像等。数据处理界面功能丰富的荧光寿命数据处理软件，充分挖掘用户数据中的宝贵信息。可自动对扫描获得的FLIM 数据，逐点进行多组分荧光寿命拟合（组分数小于等于4），对逐点拟合获得的荧光强度、荧光寿命等信息生成伪彩色图像显示。自主开发的一套时间相关单光子计数（TCSPC）荧光寿命的拟合算法，可对荧光衰减曲线中*多包含4 个时间组分的荧光过程进行拟合，获得每个组分的荧光寿命，光子数比例，计算评价函数和残差。TCSPC 荧光寿命通常并非简单的指数衰减过程，而是与光源及探测器相关的仪器响应函数（IRF）与荧光衰减过程相互卷积的结果，因此适当的拟合方法和参数选择对获得正确可靠的荧光寿命非常重要。该软件可导入实际测量的IRF 对衰减曲线进行卷积计算和拟合。但是大多数情况下， IRF 很难正确的从实验获得，针对这种情况，软件提供了两种无需实验获取IRF 的拟合方法：NO.1 通过算法对数据上升沿进行拟合，获得时间响应函数IRF，然后对整条衰减曲线进行卷积计算和拟合得到荧光寿命。NO.2对于衰减时间远长于仪器响应时间的，可对衰减曲线下降沿进行直接的指数拟合。该软件经过大量测试，可以很好的满足各种场合的用户需求。MicroLED 微盘的荧光强度像（3D 显示）：测试案例

原理介绍：GaiaMicro-G系列显微高光谱系统是将推扫型高光谱相机与显微镜结合，构成显微高光谱系统的主体，再借助显微镜的光路系统、不同倍率的物镜（可见）、不同倍率的反射物镜（红外）以及二维电控扫描平台来实现的。 可见近红外显微系统采用透射式的光路结构，在不同放大倍率物镜下，可以清楚的观察、采集到相应的显微高光谱数据，系统采用的是二维平移机构，X轴为图像扫描轴，Y轴为调焦轴，实现自动曝光、自动对焦等流程。 近红外显微系统采用半透半反射式光路结构，大功率溴钨灯输出光源能满足光谱响应范围，系统采用的方案：高光谱相机静止不动，通过控制二维平移机构的扫描轴完成图像的采集，通过特殊设计的光路结构，可以实现全透、半透半反模式的光路调整，再通过目镜来观察和手动调整焦距完成整个系统的焦距调试。 优势描述：1、自动调焦、自动曝光、自动匹配扫描速度（显微-可见近红外系统）2、反射率校准、均匀性校准、区域校准等3、二维整体精密电控平移机构4、可见近红外显微系统，可实现反射和透射式的高光谱成像，可利用GaiaField内置扫描结构带动光谱成像系统来完成，也可以借助Image-λ-V10/V10E系列相机和电控二维扫描机构来实现5、近红外显微系统，反射式显微高光谱成像系统借助Image-λ-N17E系列相机和电控二维扫描机构来实现6、高空间分辨率和光谱分辨率 显微高光谱系统主要技术参数：型号GaiaMicro-G-V10-LUGaiaMicro-G-V10E-AZ4GaiaMicro-G-N17EGaiaMicro-G-N17E-HR光谱范围400-1000nm400-1000nm900-1700nm900-1700nm光谱分辨率3.5nm2.8nm5nm5nm数值孔径F/2.8F/2.4F/2.0F/2.0狭缝尺寸30um*9.6mm30um*14.2mm30um*14.2mm30um*14.2mm探测器CCDSCMOSInGaAsInGaAs像素数（空间维*光谱维）1392*10402048*2048320*256640*512光谱通道数256(有效通道240)512(有效通道360)数据输出14 bits16 bits14 bits14 bits连接方式USB 2.0USB3.0USB2.0/GigeUSB2.0/Gige物镜平场无限远长工作距消色差金相物镜（5x、10x、20x、50x)选配：100x反射式物镜10X、40X选配：20X、30X显微系统（标配金相显微系统，透反射测试光路）无限远色差校正光学系统10X目镜30°倾斜，无限远铰链三通观察筒，瞳距调节：54mm~75mm，单边视度调节：±5屈光度，两档分光比R:T=100：0或50：50物镜转换器：内定位五孔转换器注：其它品牌如奥林巴斯、蔡司的生物、荧光、金相显微镜均可进行高光谱相机搭载，具体可与我司销售人员联系。 反射物镜： 反射物镜参数：倍率10倍20倍30倍40倍适用波长350nm～7μm350nm～7μm350nm～7μm350nm～7μm焦距ｆ19.9mm10mm6.7mm5mmNA（数值孔径NA）0.20.350.410.49视场φ1.0mmφ0.5mmφ0.34mmφ0.25mm工作距离 WD16mm7mm5mm3.5mm机械镜筒长80～∞（可変）mm遮光率约36％约36％约36％约36％ GaiaMicro-F系列显微高光谱系统GaiaMicro-F系列显微高光谱系统采用液晶可调滤光片（LCTF）为分光元件，采用高灵敏度科研级制冷型SCMOS相机为成像器件，一体化设计或直接与各种商用显微镜的相机接口（F接口）结合，无需扫描机构，具有高灵敏度、高空间分辨率的特点。 主要技术参数：