推荐厂家
暂无
暂无
细胞CCK-8增殖分析(反映群体细胞的生长) (一)原理 https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/10/202410082231070587_3898_6698225_3.jpg a在电子耦合试剂环境中,WST-8可被活细胞线粒体内的一些脱氢酶还原成橙黄色的甲臜(formazan),橙黄色的深浅与细胞的增殖成正比 b用酶标仪在450mm波长处测定OD值,可计算细胞群体的细胞活力,间接反映活细胞的数量 c以活力值为纵坐标,测定时间为横坐标,绘制生长曲线,可计算细胞的倍增时间(即在生长曲线上细胞数量增加1倍的时间 ,细胞倍增的时间区间即为对数生长期,细胞传代,实验多在此区间进行) (二) 材料 LLC-ASD细胞 CCK-8 kit 96孔板 含5%FBS的DMEM培养液(含抗生素)酶标仪 超净台 培养箱 (三)操作步骤 1 画板: 建议96孔板最外一圈的孔加入100ul/孔的PBS,中间接种 6day x 5个100μL/孔的含1000个细胞的细胞悬液并设置仅含5 个100ul/孔培养基的副孔作为空白对照。[/font] 2接种与预培养: 收集细胞,计数后用含5%FBS的DMEM培养液极限梯度稀释得5ml 1×104个/ml,剩余的细胞重新收集,以便以后做RT-PCR验证实验。 按实验设计接种细胞,注意接种时不可产生气泡,然后在培养箱中预培养30min 3 加CCK-8与培养: day0的5个孔和空白对照每孔加入10 ulCCK-8溶液,摇匀后在培养箱内孵育1.5h 4 测定当天加入CCK-8各孔在450mm波长处OD值,记录 5 每隔24h向day1~day5相应各孔加入10 ulCCK-8溶液,摇匀后在培养箱内孵育1.5h测定当天加入CCK-8各孔在450mm波长处OD值,记录 (四)细胞的倍增时间的计算: 1计算空白对照组的OD[font=宋体]值的均值A 2 day0~day5各孔OD值均减去A,记为当如该孔的细胞活力值 3以细胞活力值为纵坐标,测定时间为横坐标,绘制生长曲线,根据生长曲线确定细胞生长的对数期 4计算倍增时间 其公式为: Td=Δt×Lg2/(LgNt-LgN0)定义Td为倍增时间,Δt为计数间隔时间,Nt为对数生长期任一点在生长曲线上的理论观察值,N0为对数生长期在生长曲线上的理论初始值 注意: 1.当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。 2.在实验中吸光度值太高,如果不能减少细胞数量,可以缩短加入CCK8后的培养时间。例如:可以把加入CCK8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。 3.在CCK-8显色过程中,如何终止反应? 有以下几种方法(96孔板): 在显色反应后,将培养板放置4℃冰箱内。 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 每孔加10 μl 1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液。注意:反应停止后,应在24小时之内测定。 4.必须预培养细胞吗? 不一定。如果要向保持细胞的最好状态,建议预培养细胞。如果不做细胞预培养,细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养,但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。 5.CCK-8对于不同的细胞,灵敏度是否一样? 不一样,悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞,一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高,但对于悬浮细胞则可能吸光度较低,可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。 6.悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别? 悬浮细胞由于染色比较困那,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易,若细胞数量过大,有时吸光度会超过酶标仪的读数。 7.实验之前,是否需要先检测一下培养基和CCK-8是否会反应? 在避光条件下CCK-8试剂在4℃可保存一年。如果需要保存较长时间的话,推荐在-20℃下保存。但是CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收,从而影响检测结果,若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。 建议使用一个孔作一下检测,因为有培养基中可能含有氧化还原反应的物质,在正式实验之前有必要先确认培养基和CCK-8是否反应。一般正常在的OD值应该在0.4以下。
孔板琼脂成球分析(反映单个细胞的生长) (一)实验材料:LLC-ASD细胞 琼脂粉 超纯水 含5%FBS的DMEM培养基(含抗生素) 超净台 漩涡振荡仪 倒置显微镜 (二)基本步骤: (1)制单细胞悬液: 收集对数生长期的LLC-ASD细胞,计数后用含5%FBS的DMEM培养基极限梯度稀释得5ml 1×103个/ml,剩余的细胞重新收集,以便以后做RT-PCR验证实验。 (2)制底层琼脂: 用蒸馏水制备1%的琼脂液,待琼脂液温度刚刚不烫手时,在15ml离心管中加入5ml 1%的琼脂和5ml 5%FBS的DMEM培养基(含抗生素),迅速用漩涡振荡仪混合均匀,即刻向6孔板中每孔加入1ml混合液,摇匀铺平,待冷却凝固后,作为底层琼脂,置于超净台中备用。 (3) )制底层琼脂: 用蒸馏水制备1%的琼脂液,待琼脂液温度刚刚不烫手时,在15ml离心管中加入4.5ml 1%的琼脂和4.5ml 5%FBS的DMEM培养基(含抗生素),迅速用漩涡振荡仪混合均匀,再加入1ml 1×103个/ml的LLC-ASD细胞单细胞重悬液,用漩涡振荡仪混合均匀,得含细胞数100个/ml的0.1% 的琼脂培养基混合液。迅速向6孔板中各孔加入1ml混合液,摇匀铺平,待冷却凝固后,即为上层琼脂, (4)加培养基,观察计数: 向6孔板每孔缓慢沿壁加入1ml5%FBS的DMEM培养基(含抗生素)后放入培养箱持续培养8~10天,第4天开始每天在倒置显微镜下检查,到80%以上的细胞形成100个细胞以上的克隆球时终止培养,此时计数形成50个细胞以上的克隆球的数目,作为此孔的克隆球数。 (5)每孔克隆球数除以100,作为此孔克隆率,统计分析。 注意: 1 此实验最重要的是把握好时机,即不可动作过快,使得过热的琼脂液破坏培养基和细胞,又不可动作过慢,使得琼脂过早凝固。 2 用漩涡振荡仪时一定要充分混匀混合液,否则最终单细胞无法固定于琼脂中。具体时间视混合液体积和琼脂比例而定。
细胞在体外进行培养,失去了机体的调节和控制。因此,除满足营养的要求外,还必须使细胞生存环境尽量接近活体的环境。外环境的培养条件如温度、渗透压、酸碱度等均能影响细胞的生长。 一、温度 一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度是37~38℃。温度过高或过低都会影响到细胞的生长。细胞耐受低温的能力比抗热的能力强,在低温下,细胞的代谢活力及核分裂降低。温度不低于0℃时,虽影响细胞代谢,但并无伤害作用;把细胞置于25~35℃时,细胞仍能生存和生长,但速度减缓;放在40℃数小时后,再置回37℃培养细胞仍能继续生长。但如果在40℃下暴露时间太长,对细胞生长不利,甚至变圆脱落于瓶壁。若温度过低,在降到冰点以下时,细胞因胞外水和胞质结冰而受损死亡。但若向培养液中加入甘油或二甲亚砜等保护剂,封入安瓿中后,置于液氮中,可起保护作用,此时细胞可耐受-70℃以下温度,能长期储存,解冻后细胞复苏,仍能继续生长增殖,细胞生物性状不受任何影响。此为保存细胞的主要手段。 高温对细胞培养不利。细胞在39~40℃培养1小时,能受到一定损伤,但仍有可能恢复,但不能忍受温度再升高2℃,持续数小时,即在41~42℃中培养1小时,细胞损伤严重,温度至43℃以上时细胞多数被杀死。高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏,核分裂的破坏,产生凝固酶使细胞发生凝固,另外使蛋白质变性。因此,体外培养细胞时一定要避免高温。 二、渗透压 细胞在高渗溶液或低渗溶液中,可以立即发生皱缩或肿胀、破裂。所以,渗透压是体外培养细胞的重要条件之一。哺乳动物和其他动物组织细胞体外培养的渗透压的维持主要与NaCl有关,但不能忽视其他电介质渗透压的关系。渗透压与单位体积溶媒内溶质的分子数和离子数成正比。为此,按一定比例控制培养液中离子平衡,维持正常渗透压是很重要的。这不仅是为了维持细胞张力,而且是为了调节细胞的代谢。因为细胞外离子输送和离子浓度改变着其他营养物质的输送(如氨基酸、蔗糖等),直接影响细胞基本合成系统。 理想的渗透压因细胞的类型及种族而异,人血浆渗透压为290mmol/L,被视为是体外培养人类细胞的理想渗透压。哺乳类动物细胞的渗透压一般为290~300mmol/L。人胚肺成纤维细胞为250~325mmol/L,鼠则为310mmol/L左右。在实际应用中,260~320mmol/L的渗透压可适于大多数细胞。