针入度检测

我要测讯 诺如病毒(Norovirus)是一组杯状病毒属病毒，其原型株诺瓦克病毒(Norwalk-like viruses)于1968年在美国诺瓦克市被分离发现。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。感染者发病突然，主要症状为恶心、呕吐、发热、腹痛和腹泻。　　世界上很多地区都有暴发的案例，例如2010年广州从化因为水污染引起的诺如病毒感染事件，共有429人发病 2012年9月底，德国首都柏林以及东部三个地区1万多名小学生和托儿所的幼儿发生疑以诺如病毒食物中毒 尤其以2012年12月，日本各地接连发生一系列因诺如病毒而引起的集体食品中毒事件最此人关注，从爱知县名古屋市一直到广岛县广岛市总的中毒人数1809人。　　诺如病毒是全球流行性与散发性腹泻的主要病原之一，受污染的食品、水源是诺如病毒传播的重要污染源，例如贝类、水果、蔬菜、饮用水、水源水等。目前，我国在食品与水样中诺如病毒检测方面还没建立有相关的国家标准。根据文献报道，诺如病毒的检测方法主要包括电镜法、免疫法及分子扩增法(主要为PCR方法)，其中分子扩增方法被认为是食品中检测诺如病毒的唯一方法(其他两种方法灵敏度差)，而PCR则为“金标准”而被广泛作地采用。因此，完整的食品与水样中诺如病毒检测的主要流程共包括病毒的提取、核酸的纯化以及病毒的分子检测。　　食品及水样中诺如病毒的检测方法　　(protease K digestion & real-time reverse transcription-PCR)　　一、实验原理　　挑取被检样本或者被检样本中病毒易富集部位(例如贝类的消化腺组织)，通过蛋白酶K消化的方法解离病毒，然后通过异硫氰酸胍等试剂纯化病毒RNA，接下来继续将病毒RNA进行反转录，最后将产物cDNA进行PCR检测。　　二、仪器和试剂　　荧光定量PCR仪、振荡培养箱、涡旋振荡器、离心机，TRIzol试剂、MMLV反转录试剂盒、Taqman realtime-PCR试剂盒超均为商品化试剂，其他试剂为国产分析纯，实验用水为不含核酸酶的超纯水。　　三、实验方法　　1.食品前处理　　选取被检适当量样本(不同种类食品样本量不同)。以贝类样本为例，一般取5~10个左右，用无菌水冲洗干净贝壳表面后撬开贝壳，然后用无菌的手术刀切取其中的消化腺组织共1.5g，并尽量切碎贝类组织。　　2.蛋白酶K消化　　诺如病毒解离的方法有很多，包括PEG沉淀法、超滤法、超速离心法等等，而蛋白酶K消化的方法由于其自身简单、耗时短、稳定性高等特点，而被欧洲标准化委员会认定为贝类中诺如病毒解离的标准操作方法。　　①向1.5g被检样本中加入2mL PBS，并加入蛋白酶K至浓度0.2mg/mL 　　②涡旋振荡混匀后，置于37℃、300r/min的振荡器中孵育1h 　　③孵育后样本置于65℃10min，进行蛋白酶K灭活处理 　　④灭活后样本于3000r/min下离心5min，取上清进行下一步实验。　　3.核酸纯化　　RNA纯化用硅胶膜试剂盒与TRIzol试剂是目前主要采用的病毒RNA的纯化方法。目前本实验室采用TRIzol试剂法进行诺如病毒RNA的纯化：　　①取300μL上清液，加入到含1mL预冷的Trizol的EP管中，混匀后室温放置5min，加入0.2mL氯仿，充分混匀或旋窝震荡15s，室温放置5min，12000g离心15min 　　②小心取上层水相600μL至含有预冷的600μL异丙醇的EP管中，混匀，室温放置10min，12000g离心10min 　　③小心倒掉上清，加入1ml 75%乙醇(用DEPC处理的水进行配制)，洗涤沉淀，12000g离心5min 倒掉上清，尽量吸净残留液体，室温放置风干数分钟 　　④加入50μL无Rnase的H2O溶解RNA，可选择于70℃水浴5min加速RNA溶解，然后放于-80℃保存或直接用于反转录操作。　　4.反转录　　本实验目前采用两步法RT-PCR的方法进行诺如病毒的检测，因此首先将纯化的RNA进行反转录操作。采用M-MLV反转录试剂盒进行病毒RNA的反转录：　　①取10μLRNA，2μL Rondom Primer(50uM)，5.5μL无Rnase的H2O，混匀后70℃热激5min并立即冰浴 　　②加入1μLM-MLV(200U/ul)，0.5μLRNA酶抑制剂(40U/μL)，5μL5×Buffer，1μL dNTP(10μmol/L)，共25μL混匀离心 　　③按以下程序进行反转录：30℃预处理10min，37℃反转录60min，最后70℃处理15min以灭活反转录酶等。　　5.PCR检测　　PCR检测的方法可分为定性检测与定量检测，而realtime PCR被引入到诺如病毒检测后，由于其灵敏度高、检测时间短、污染风险小等优点而被广泛使用。本实验室目前采用Taqman realtime-PCR方法进行诺如病毒的定量检测。　　①采用国际上普遍使用的引物与探针 名称引物序列方向QNIF2dATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA+COG2RTCGACGCCATCTTCATTCACA-QNIFSFAM- AGCACGTGGGAGGGGATCG -TAMRA QNIF4CGCTGGATGCGNTTCCAT+NV1LCRCCTTAGACGCCATCATCATTTAC-NV1LCprTGGACAGGAGAYCGCRATCT 　　②首先加入10 μL 2×PCR Mix，然后加入适当浓度的引物及探针，然后加入2 μL模板，最后ddH2O补足20 μL体系。　　③按以下程序进行反应：94℃预变性10 s，然后94℃变性5 s，60℃延伸20 s，共循环45次。图1 荧光定量PCR仪图2 荧光定量PCR反应　　5.对照设置　　为了保证实验的准确性，在过程每一步均设立阳性对照与阴性对照。其中阴性对照均采用超纯水，而阳性对照分别为：PCR过程采用构建的标准质粒，RT过程采用标准质粒体外转录得到的标准RNA。　　四、附图：Realtime PCR定量检测的标准曲线图3 两步法Taqman RT-qPCR标准曲线　　其中X轴为检测模板拷贝数的对数值，Y轴为qPCR检测的CT值。一般以CT值处于15~35之间为检测范围，对应的检测模板量约为102~108copies。　　附：广东省微生物分析检测中心　　广东省微生物分析检测中心是1999年经广东省机构编制委员会批准，在广东省微生物研究所的基础上成立，并于当年通过计量认证(CMA)，现隶属广东省科学院，在检测业务上接受广东省质量技术监督局领导。2004年，中心通过中国实验室国家认可委员会(CNAS)认可，是具有独立法人地位的第三方实检测验室。　　主要对外业务包括：食品、保健品、饮料及饮用水检测 食品安全性检测与评价 农产品检测 药品、一次性使用医疗用品检测 化妆品、日化产品、卫生用品检测 防霉、抗菌、消毒产品及消毒器械的检测 玩具、电器、空气净化器、室内装饰装修材料检测 公共场所用具及包材检测 微生物菌剂的环境安全性测试和评价 水质检测 空气检测 菌种鉴定 微生物控制及检测培训与技术服务等。　　检测中心自成立以来，业务遍及全国，具有很高的知名度和影响力。检测中心的科技人员积极跟踪国内外相关行业的国际标准、国家标准的制定、修订的发展情况，主持和参与了50多项国家标准、行业标准、地方标准的制修订工作。2006年被广东省科技厅批准为 “广东省食品安全检测与评价科技创新平台”食品微生物安全性检测与评价中心，并成为该平台建设的主要承担单位。2010年亚运会在广州举办之时，受邀参与“第十六届亚运会公共卫生保障合作实验室”，成为广州地区共同承担“亚运期间新发传染病、食物中毒等重大突发公共卫生事件实验室检验检测工作”的8家实验室之一。

p　　2016年1月23日，广东省深圳市卫计委副主任率先发声，建议将孕妇无创产前基因检测纳入医保。据深圳晚报报道，深圳市卫计委副主任许四虎建议，将孕妇无创产前基因检测、孕妇地中海贫血基因检测、新生儿遗传性耳聋基因检测在全省范围内纳入医疗保险进行筛查。/pp　　许四虎谈及了广东省出生缺陷的具体数据：2010年全省出生缺陷率就上升到了275.8/万，其中耳聋、唐氏综合症、先天性心脏病等高发病种占63%，育龄人群地中海贫血基因携带率为16.8%，平均6人就有1个携带该基因。/pp　　“这些出生缺陷与遗传、环境污染、产妇高龄等有关，遗传因素占70%以上，最佳的预防方法是通过基因检测进行早期预防。”许四虎解释道，目前，医院开展的传统唐筛为血清学检测，假阳性率超过5%，检出率最高约83%。“胎儿染色体非整倍体”无创产前基因检测方法是目前准确率最高(高达99%以上)、风险最小的产前筛查技术。为此，他建议全省推广高准确率、高通量、低成本的基因检测技术，让广东成为第一个没有“唐娃娃”(唐氏综合症)的省份。此外，他还建议将新生儿耳聋基因检测和地中海贫血检测，连同孕妇无创产前基因检测纳入医保进行筛查。/pp　　悉知，“无创产前基因检测”已于2013年纳入了深圳市社保生育保险范畴，生育保险参保人接受无创产前基因检测的，由生育保险基因每人每次支付400元即可。那么，“无创产前基因检测”纳入深圳医保，还有多远?/p

p　　2月13日，湖北省卫健委通报最新疫情情况，12日0时-24时全省新增新冠肺炎病例14840例，累计48206例。新增病例数突然激增，引起广泛的关注和讨论。/pp　　首先，无需恐慌，这14840新增病例中包含了13332例临床诊断病例。对此，湖北省卫健委解释，国家卫生健康委办公厅、国家中医药管理局办公室印发的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》在湖北省的病例诊断分类中增加了“临床诊断”，以便患者能及早按照确诊病例接受规范治疗，进一步提高救治成功率。根据该方案，近期湖北省对既往的疑似病例开展了排查并对诊断结果进行了订正，对新就诊患者按照新的诊断分类进行诊断。为与全国其他省份对外发布的病例诊断分类一致，从今天起，湖北省将临床诊断病例数纳入确诊病例数进行公布。/pp　　实际上，早在2月3日，武汉大学中南医院影像科主任医师张笑春就在微信朋友圈里呼吁启动疑似病例接触者CT排查机制。她表示：““目前武汉市家庭聚集性发病越来越多，而且大多起病隐匿，一次甚至多次核酸（检测呈）阴性，无任何临床症状，如采取居家留观的方式，必然造成疫情进一步蔓延。”鉴于此，她建议武汉市疾控部门即刻启动与疑似病例有过接触者的CT排查筛查机制，“只要CT阳性就近集中隔离于酒店、宾馆或学校，由专业人员统一管理，发放药品，动员社会力量参与工作。”/pp　　从今日起，湖北省将临床诊断病例数纳入确诊病例数进行公布。那么，临床诊断病例代表什么含义？在病例确诊上，CT检测是否将取代核酸检测呢？/pp style="text-align: center "img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 260px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/81edf109-ce5b-48ec-a222-8615d574d052.jpg" title="1581559900989.jpg" alt="1581559900989.jpg" width="600" height="260" border="0" vspace="0"//pp　　对此，中央指导组专家，北京朝阳医院副院长童朝晖在接受央视记者采访时表示：“在临床工作中，主要从这几个方面综合诊断：第一，如果病人在湖北或者在武汉地区，那肯定是已经有流行病学史了；第二是发热、呼吸道咳嗽、憋气的症状，这是临床症状；第三是临床有体征，查体检查；第四个是CT影像。实际上，在看病诊断肺炎时，能够拿得到的病原学（病例诊断），也就百分之二三十，剩下的百分之七八十要靠临床诊断。从临床思维和临床医生的临床路径角度来说，增加临床病例的诊断，有益于临床医生对疾病多一个判断。”/pp　　而对于核酸检测和CT检测哪个更重要？童朝晖院长表示：“实际上我们在临床工作中都是要有依据的。病人的病史、症状体征、临床化验、CT，都要分析，这些对临床医生来讲都不可缺少，需要做综合判断，综合分析。因此，做疾病综合诊断的时候，化验和CT影像，我们要综合分析，不能强调某一个的重要性。”/pp　　除了专家专业性的解读外，我们也注意到，从1月23日起，数以万计的“美丽逆行者”放弃新年的团聚，奔赴最艰苦卓绝的抗疫战场—湖北。据依照各省市卫健委官网及公开信息的不完全统计，截至2月10日，全国已有近两万名医疗人员前往湖北支援。同时，继2月2日武汉火神山医院正式交付之后，2月8日，武汉雷神山医院1600张病床交付使用。/pp　　此时，有关政府机构调整了确诊病例的诊断标准，这也许说明武汉乃至湖北对于大规模收治确诊病人的物质条件已进一步成熟，“决战”的时刻到了！/p