利用高效液相检测

利用紫外和荧光光谱扫描技术开发高效液相色谱-荧光检测方法全过程荧光是光致发光中的一种，荧光过程是物质吸收入射光进入激发态，从激发态回到基态并发出波长更长得光的过程，在此过程中，物质吸收的光为激发光，发出的光为发射光（这个定义并不准确，有兴趣的版友可以参照相关教科书）。荧光检测在高效液相色谱中是比紫外检测更灵敏的检测方法，但是能够发出荧光的物质并不多，如何判断分析物有没有荧光特性并优化荧光检测器参数是荧光检测方法开发过程的重要内容。荧光检测方法优化的最重要两个参数是确定激发波长和发射波长。二极管阵列检测器（DAD）可以提供分析物在流动相的紫外吸收光谱，基于提取的紫外吸收光谱在日常高效液相色谱分分析中主要有两大作用：1.发现并确定紫外检测器的最佳检测波长；2进行进一步的运算做峰纯度检查，判断有没有共流出物。在这里通过实例向大家介绍二极管阵列检测器的另一用处：二极管阵列检测器辅助荧光检测器开发分析物的高效液相色谱-荧光检测方法。1实验设备和基本实验条件：Waters 2695分离单元Waters 2996 二极管阵列检测器Waters 2475 荧光检测器二极管阵列检测器和荧光检测器串列，荧光检测器在后（检测池耐压较差）二者之间死体积为1ml/min×0.1min。分析物为两种原料药色谱柱：C18，4.6×150mm，5μm柱温：30℃流动相：乙腈：醋酸盐缓冲溶液=65:352实验A：二极管阵列检测器获取紫外吸收光谱，荧光检测器扫描发射光谱实验仪器设置 :2996 3D采集模式，获取210-400nm紫外吸收谱图2475 3D采集模式，固定激发波长220nm（一般有紫外吸收的物质在210-230nm都有吸收），获取250-650nm发射光谱。利用二极管阵列检测器来判断化合物的出峰时间，图1是在254nm下提取的分析物1和分析物2的色谱图，信号很弱。依照二极管整列检测器提取的色谱图，根据连接二极管阵列检测器和荧光检测器的管路体积，推算二者之间死时间约为0.1min。在荧光检测器中调出发射波长3D图，在250-650nm每间隔50nm提取一次色谱图（即250nm，300nm，350nm…），根据紫外色谱图的分析物保留时间，确定荧光色谱图中分析物的出峰时间。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/12/201112130845_337609_2265735_3.jpg图1 二极管阵列检测器色谱图和提取的分析物紫外吸收色谱图在提取的荧光色谱图中，分析物1有荧光（300nm，图2），而分析物2没有。在荧光检测中，会有很多杂质峰出现（图3，在发射400nm提取的色谱图），而紫外检测器中不一定会发现，利用二极管阵列检测器获得的谱图有利于准确定位分析物在荧光色谱图出现的位置，排除杂质干扰（图3）。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/12/201112130846_337610_2265735_3.jpg图2 从激发波谱300nm发射光提取的色谱图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/12/201112130848_337612

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