荧光定量原理

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  • Invitrogen Qubit 4 核酸/蛋白质定量荧光计 400-807-5250
    最新款 Qubit Flex 八通道核酸/蛋白定量荧光计 已上市！Qubit 4 荧光计采用专门研制的荧光检测技术和Invitrogen™ Molecular Probes™ 染料。这些染料荧光只有与特异性的靶分子结合时，才能发射荧光信号，即使有游离核苷酸或降解核酸存在，这些染料仍能发挥作用。Qubit 4 荧光定量即便在低浓度下亦具有目前最高的DNA 和RNA 定量特异性和灵敏度。? 选择性 — Qubit 荧光定量采用Qubit 分析试剂盒，其包括专利的染料，只有与DNA、RNA或蛋白质结合时方可发出荧光。由于Qubit 技术只报告靶分子( 而不是杂质) 的浓度，因此这种特异性可以使您获得十分精确的结果? 灵敏性 — 最低仅需1 uL 样品，能精确可靠地定量浓度仅为10pg/L 的DNA 和12.5μg/mL 的蛋白质样本? 简单直观 — 反应灵敏的5.7 英寸彩色触摸屏，直观的导航按钮? 迅速 — 全新的双核处理器，5 秒内快速计算样品浓度，最多存储1000 个结果? 个性化 — 个性化设置常规应用，可通过MyQubit 软件和网络工具创建个性化assay，六国操作语言可供选择上市12 年来，Qubit 荧光计一直以其极高的准确度和灵敏性，受到全球上万个实验室的青睐。迄今为止，已经有17,500 篇有关Qubit 的文献引述。最新推出的Qubit 4 荧光计秉承上一代仪器的高准确性，不仅仅可精确测量样品DNA，RNA 和蛋白质含量，还拥有全新的功能，包括：? 适用全新RNA IQ assay — 快速可靠地检测RNA 完整性和质量? 数据导出 — 除U 盘和USB 连接电脑导出数据，还拥有WiFi 功能? 内置试剂计算器 — 快速计算配置工作溶液所需的染料和缓冲液Qubit 操作简单直观ubit RNA IQ Assay快速、准确地检测RNA 完整性和质量RNA 样品的质量评估对于下游的实验的成功尤为重要。全新上市的InvitrogenTM Qubit RNA IQ（Integrity & Quality ）试剂盒和Qubit 4 荧光计配套使用，只需两步就可以准确区分完整和降解RNA，快速评估RNA 质量或降解程度。无需特殊的处理步骤，繁杂的样本制备或漫长的等待过程——最少仅需1 uL，浓度为0.5-1.5 ug/uL 的待测样品，即可在4 秒内获得RNA IQ 结果。Qubit RNA IQ 试剂盒采用两种独特的荧光染料——一种与大RNA，完整和/ 或结构RNA 结合，另一种选择性地结合较小、降解的RNA（图5），两种染料结合使用，可快速地评估RNA样品的完整性和质量。使用时，您只需将样本加入RNA IQ 工作液，然后在Qubit 4 荧光计上完成检测。检测结果会提供RNA 样品完整性和质量的总数值或RNA IQ#，以及样本中大小RNA 的百分比值（图6）。与其他RNA 质量分数类似，RNAIQ# 评分范围为1 到10，数值越大，说明RNA 的质量越高，完整性越好。 与电泳法相比，RNA IQ 检测法有何优势？Qubit RNA IQ 为检测RNA 样本是否降解提供一种快速简单的方法。与基于微流体芯片法比较，RNA IQ 法需要的设备便宜，操作简单，更重要的是检测所需的时间大大缩短。通常来说，完成12 个样品的检测，RNA IQ 法约需要10 分钟，而使用微流体法，约需要75 分钟。如果您只是需要简单评估RNA 样品是否降解，可以使用RNA IQ 法快速完成检测，但如果您需要获取具体的RNA 片段大小及分布信息，我们依然推荐您使用基于凝胶或微流体的电泳方法。RNA IQ 检测结果反映样本中大RNA 和/ 或结构RNA 和小RNA的百分比，其数值与电泳法结果正相关（图7）。然而，需要注意的是IQ# 值反映的是样本中大小RNA 的比值，由于计算原理不同，IQ# 值与其他质量评估方法得到的结果之间存在一些差异（图8）。对特定样本或下游应用，我们推荐您最开始同时使用RNA IQ 试剂盒和传统电泳法来确定测量值的相关性。官方渠道购买 — 品质保证，售后无忧从现在起，通过赛默飞世尔科技官方渠道购买全新Qubit 4 荧光计，即享三年免费退换。
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    厂商： 赛默飞世尔科技生命科学产品
    品牌： Invitrogen
    型号： Qubit 4
    价格： 面议
  • 荧光定量PCR仪 400-860-5168转5113
    荧光定量PCR仪的主要技术原理是实时荧光定量检测，通过在PCR反应体系中加入荧光基团或荧光探针，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程。在PCR扩增过程中，荧光信号会随着产物量的增加而增强，通过对荧光信号的定量分析，可以计算出待测样品的初始浓度。实时荧光定量PCR系统简介荧光定量PCR仪主要用于运行实时荧光定量PCR实验，通过荧光激发和采集的方式，对实验过程进行实时监控，将实验过程数据绘制成荧光曲线，实时呈现于仪器显示界面，并对实验数据进行拟合和分析，最后可生成PDF格式的实验报告。对取于其他动物体内的生物样本（如血液，体液等）中包含的目标核酸，进行快速精准的定性和定量分析，同时也能够对特殊样本进行标准曲线，熔解曲线，基因分型等分析。基本原理实时荧光定量PCR仪器的原理：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA扩增，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个温度循环周期，使目的基因得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，是基因扩增技术的一次重大革新。PCR技术可将极微量的目标DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力。实时荧光定量PCR技术是在常规PCR基础上加入相应的荧光染料或荧光标记探针，在PCR反应过程中通过荧光信号变化，对整个PCR进程进行实时检测，以荧光化学物质监测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法，通过内参或外参的方法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR系统应用领域◆食源性致病菌检测 ◆动植物源性检测◆植物科学与农业生物技术◆基因突变及多态性◆基础科学研究◆水体监测◆病原核酸检测◆ 转基因检测◆动物疫情监测◆食品卫生检疫◆海关进出口检疫仪器基本结构实时荧光定量PCR系统是实时检测反应的仪器，主要由基因扩增热循环系统、荧光实时检测系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中两个核心功能模块：热循环系统和荧光实时检测系统。其中基因扩增热循环系统工作原理与传统基因扩增仪工作原理基本相同，采用半导体加热制冷工作方式完成热循环过程。荧光检测系统主要有由荧光激发部件、光信号传输部件、荧光检测部件、控制系统组成。仪器特点：1、体积小，重量轻，方便携带，兼容0.2PCR单管、八联管；2、采用美国MARLOW定制型帕尔贴模块高级别半导体芯片，新一代半导体升降温技术，最快变温速率可达每秒7度，使用寿命可达一百万次循环；3、采用独有的采光检测处理技术，自动调节荧光本底，提高荧光信号灵敏度和信噪比，获得更佳结果；4、13S四通道快速采光，荧光采集信号稳定，减少延时误差；5、采用免维护的长寿命LED光源，无需更换，独立荧光通道，不同通道之间的串扰更小；6、 恒流式控制电路，功率输出平滑，延长 Peltier寿命，提高控温精度；7、具有过流、过温、瞬时断电数据自恢复等保护功能，仪器重启后继续运行未完成实验，确保实验安全运行；8、强大的软件分析功能，可以进行定量分析，熔解曲线分析，基因分型等，分析软件终身免费升级，支持不同行业的软件定制； 9、支持恒温、荧光定量双模式，适配市面上多数的恒温PCR试剂盒和荧光定量PCR试剂盒； 10、自带10寸指标名称H160H320H480外观外形尺寸235mm*385mm*175mm（宽*深*高）重量5.6kg5.7kg5.8Kg电气参数~220V/50Hz，255W数据接口USB 2.0 *2（右侧两个）环境参数运行条件温度：10-30℃，湿度：20%~80%运输及贮存条件温度：-20~55℃，湿度：20%~80%海拔高度2500米噪声等级A计权，60dB样本参数样本容量16*0.2mL32*0.2mL48*0.2mL试管类型单管，八联排试管样本容积15-100uL温度特性加热/冷却方式半导体加热/制冷温度范围4℃-99℃最大升温速率≥5.5℃/s平均升温速率≥3.5℃/s最大降温速率≥4.5℃/s平均降温速率≥2.5℃/s控温精度≤±0.01℃温度准确度≤±0.1℃温度均匀性≤±0.3℃光学特性荧光检测通道数4通道发光器件高亮度LED采光器件高灵敏度，高信噪比光电二极管适配探针或染料第一通道：470/520 FAM,SYBR Green第二通道：530/570 HEX,JOE,VIC第三通道：580/610 ROX,CY3.5,Texas-Red第四通道：630/670 CY5检测灵敏度1个拷贝线性检测范围100~1010个拷贝线性相关系数≥0.999通道交叉串扰无串扰检测重复性≤1.0%
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    厂商： 山东天蔚环境科技有限公司
    品牌： 天合/tianhe/shandongtianhe
    型号： TH -H320
    价格： 3.2万元
  • 实时荧光定量PCR仪 400-860-5168转5113
    实时荧光定量PCR仪【TH-Q160】是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法实时荧光定量PCR系统简介实时荧光定量PCR系统主要用于运行实时荧光定量PCR实验，通过荧光激发和采集的方式，对实验过程进行实时监控，将实验过程数据绘制成荧光曲线，实时呈现于仪器显示界面，并对实验数据进行拟合和分析，最后可生成PDF格式的实验报告。对取于其他动物体内的生物样本（如血液，体液等）中包含的目标核酸，进行快速精准的定性和定量分析，同时也能够对特殊样本进行标准曲线，熔解曲线，基因分型等分析。基本原理实时荧光定量PCR仪器的原理：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA扩增，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个温度循环周期，使目的基因得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，是基因扩增技术的一次重大革新。PCR技术可将极微量的目标DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力。实时荧光定量PCR技术是在常规PCR基础上加入相应的荧光染料或荧光标记探针，在PCR反应过程中通过荧光信号变化，对整个PCR进程进行实时检测，以荧光化学物质监测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法，通过内参或外参的方法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR系统应用领域◆食源性致病菌检测 ◆动植物源性检测◆植物科学与农业生物技术◆基因突变及多态性◆基础科学研究◆水体监测◆病原核酸检测◆ 转基因检测◆动物疫情监测◆食品卫生检疫◆海关进出口检疫仪器基本结构实时荧光定量PCR系统是实时检测反应的仪器，主要由基因扩增热循环系统、荧光实时检测系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中两个核心功能模块：热循环系统和荧光实时检测系统。其中基因扩增热循环系统工作原理与传统基因扩增仪工作原理基本相同，采用半导体加热制冷工作方式完成热循环过程。荧光检测系统主要有由荧光激发部件、光信号传输部件、荧光检测部件、控制系统组成。仪器特点：1、体积小，重量轻，方便携带，兼容0.2PCR单管、八联管；2、采用美国MARLOW定制型帕尔贴模块高级别半导体芯片，新一代半导体升降温技术，最快变温速率可达每秒7度，使用寿命可达一百万次循环；3、采用独有的采光检测处理技术，自动调节荧光本底，提高荧光信号灵敏度和信噪比，获得更佳结果；4、13S四通道快速采光，荧光采集信号稳定，减少延时误差；5、采用免维护的长寿命LED光源，无需更换，独立荧光通道，不同通道之间的串扰更小；6、 恒流式控制电路，功率输出平滑，延长 Peltier寿命，提高控温精度；7、具有过流、过温、瞬时断电数据自恢复等保护功能，仪器重启后继续运行未完成实验，确保实验安全运行；8、强大的软件分析功能，可以进行定量分析，熔解曲线分析，基因分型等，分析软件终身免费升级，支持不同行业的软件定制； 9、支持恒温、荧光定量双模式，适配市面上多数的恒温PCR试剂盒和荧光定量PCR试剂盒； 10、自带10寸彩色触摸屏控制，也可以连接电脑控制。仪器技术指标“///” 符号表示国家标准目前没有定义该项指标或者强制性要求。指标名称H160H320H480外观外形尺寸235mm*385mm*175mm（宽*深*高）重量5.6kg5.7kg5.8Kg电气参数~220V/50Hz，255W数据接口USB 2.0 *2（右侧两个）环境参数运行条件温度：10-30℃，湿度：20%~80%运输及贮存条件温度：-20~55℃，湿度：20%~80%海拔高度2500米噪声等级A计权，60dB样本参数样本容量16*0.2mL32*0.2mL48*0.2mL试管类型单管，八联排试管样本容积15-100uL温度特性加热/冷却方式半导体加热/制冷温度范围4℃-99℃最大升温速率≥5.5℃/s平均升温速率≥3.5℃/s最大降温速率≥4.5℃/s平均降温速率≥2.5℃/s控温精度≤±0.01℃温度准确度≤±0.1℃温度均匀性≤±0.3℃光学特性荧光检测通道数4通道发光器件高亮度LED采光器件高灵敏度，高信噪比光电二极管适配探针或染料第一通道：470/520 FAM,SYBR Green第二通道：530/570 HEX,JOE,VIC第三通道：580/610 ROX,CY3.5,Texas-Red第四通道：630/670 CY5检测灵敏度1个拷贝线性检测范围100~1010个拷贝线性相关系数≥0.999通道交叉串扰无串扰检测重复性≤1.0%
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    厂商： 山东天蔚环境科技有限公司
    品牌： 天合环境/TH
    型号： TH-Q160
    价格： 4.2万元
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  • 荧光定量PCR：简介、原理、应用

    荧光定量PCR简介荧光定量PCR检测技术诞生至今已10多年的时间，而其应用一直都没广泛展开，究其原因，无外乎受制于相关仪器、试剂和技术的发展。近期，尤其是08年以来，仪器和试剂是遍地开花，这也使科研人员均跃跃欲试，都想借此技术使自己的研究能突飞猛进，发展势头通过查找每年所发表的文章数可一目了然。据有关统计，在 Medline 数据库中，用“Taqman” 或 ”real time PCR” 作为关键词检索，1996 年是19 篇，1999 年157 篇，到2003 年就高达2984 篇，2009年会是多少呢？我们不得而知。但其迅猛的发展势头却是不可更改的，本公司真诚希望能和众多研究人员共同努力，抓住这一大好时机，为科研事业的发展贡献自身的力量。基于这一目标，本公司长期以来对荧光定量PCR，无论是技术还是多年来的产品，均进行了深入地研究，并及时推出更加优异的荧光定量 PCR技术服务。荧光定量PCR原理荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT值（如下图所示）。荧光域值（threshold）是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍，即：threshold。http://www.biomart.cn/upload/asset/2011/01/25/1295364674.jpgCt 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值如下图所示。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。http://www.biomart.cn/upload/asset/2011/01/25/1295364675.jpg荧光定量检测荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包括Beacon技术（分子信标技术，以美国人Tagyi为代表）、 TaqMan探针（以美国ABI公司为代表）和FRET技术（以罗氏公司为代表）等；荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBR GreenⅠ；饱和荧光染料有EvaGreen、LC Green等。嵌合荧光染料法（SYBR GreenⅠ）SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。http://www.biomart.cn/upload/asset/2011/01/25/1295364672.gifSYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合双链DNA结合染料的优点：实验设计简单，仅需要2个引物，不需要设计探针，无需设计多个探针即可以快速检验多个基因，且能够进行熔点曲线分析，检验扩增反应的特异性，低的初始成本，通用性好，因此国内外在科研中使用比较普遍。荧光探针法（Taqman 技术）：PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号； PCR扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的 5' － 3' 切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。其过程如下图所示http://www.biomart.cn/upload/asset/2011/01/25/1295364673.gif荧光定量PCR的应用分子生物学研究1、核酸定量分析。 对传染性疾病进行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的检测 , 比如近期流行的甲型H1N1流感， 转基因动植物基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等。2 、基因表达差异分析。 比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证3 、SNP 检测。检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，因分子信标结构的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变得简单而准确。4、 甲基化检测。甲基化同人类的许多疾病有关，特别是癌症， Laird 报道了一种称作 Methylight的技术，在扩增之前先处理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高。医学研究1、 产前诊断：人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，到目前为止，还只能只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。2、 病原体检测：采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。3、 药物疗效考核：对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV- DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。4、 肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量 PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤 ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。

  • qPCR定量分析原理及荧光标记方法有哪些？

    [font=宋体][font=Calibri]qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]常常被用来对[/font][font=Calibri]RNA-seq[/font][font=宋体]或芯片测序得到的有意义的基因表达情况进行准确的定量分析，本文主要从[/font][font=Calibri]qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]的原理、定量方法等方面进行讲解。[/font][/font][font=宋体] [/font][table][tr][td][align=center][b][font=微软雅黑]区别[/font][/b][/align][/td][td][align=center][b][font=微软雅黑][font=微软雅黑]荧光定量[/font][font=微软雅黑][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][/font][/b][/align][/td][td][align=center][b][font=微软雅黑][font=微软雅黑]常规[/font][font=微软雅黑][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][/font][/b][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][b][font=微软雅黑]检测时间[/font][/b][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑][font=微软雅黑]实时[/font][font=微软雅黑]+终点[/font][/font][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]终点[/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][b][font=微软雅黑]检测信号[/font][/b][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]荧光染料或者探针[/font][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]核酸染料[/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][b][font=微软雅黑]准确度[/font][/b][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]定量[/font][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]半定量[/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][b][font=微软雅黑]是否能检测终点产物[/font][/b][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]能[/font][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]能[/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][b][font=微软雅黑]是否能计算起始浓度[/font][/b][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]能[/font][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]否[/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][b][font=微软雅黑]仪器要求[/font][/b][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑][font=微软雅黑]荧光定量[/font][font=微软雅黑][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪[/font][/font][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑][font=微软雅黑]常规[/font][font=微软雅黑][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪[/font][/font][/align][/td][/tr][/table][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]一、[/font][font=Calibri]qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]定量原理[/font][/font][/b][font=宋体][font=Calibri]qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]，即实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]，就是通过对[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增反应每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板的定量分析。因为在[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增的指数时期，模板的[/font][font=Calibri]Ct [/font][font=宋体]值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以定量。（[/font][font=Calibri]Ct [/font][font=宋体]值：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 [/font][font=Calibri](cycle)[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]Ct [/font][font=宋体]值越小，反应扩增到达平台期所需循环数越少，目的基因起始含量越高）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]的荧光标记方法分为以[/font][font=Calibri]SYBR Green I[/font][font=宋体]染料法为主的荧光染料嵌合法，以[/font][font=Calibri]Taqman[/font][font=宋体]探针法为主的荧光探针法（[/font][font=Calibri]Cycling Probe[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]Molecular Bracon[/font][font=宋体]等），淬灭染料引物法。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]①[/font][font=Calibri]SYBR Green I[/font][font=宋体]染料法[/font][/font][/b][font=宋体][font=Calibri]SYBR Green I [/font][font=宋体]是高灵敏度的非特异性双链[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]荧光染料，具有绿色激发波长。它以非特异性方式结合在[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]双螺旋小沟区域。游离的[/font][font=Calibri]SYBR Green I [/font][font=宋体]只发出微弱的荧光信号，[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]过程中，当扩增生成[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]时，[/font][font=Calibri]SYBR Green I [/font][font=宋体]逐渐与[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]结合，荧光信号被千倍放大，荧光信号的强度与扩增得到的[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]的浓度成正比。荧光信号被仪器检测并采集得到“扩增曲线”，通过荧光信号的强度反映出体系中[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]的浓度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]但[/font][font=Calibri]SYBR Green I [/font][font=宋体]与特异性扩增产物结合时还可以同引物二聚体、非特异性扩增的[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]结合，影响结果判断。所以扩增反应结束后，还必须对生成的[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]进行分析：即通过升温，[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]双链解开，[/font][font=Calibri]SYBR Green I [/font][font=宋体]染料脱落，荧光值逐渐下降，形成温度和荧光强度的曲线即“熔解曲线（[/font][font=Calibri]Melting curve[/font][font=宋体]）”，由此判断体系中是否存在引物二聚体、非特异性扩增。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]SYBR Green I [/font][font=宋体]染料法操作简单、灵敏度高、成本较低，被广泛地应用于[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]及[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]定量、 基因表达量的研究、转基因重组动植物的研究等。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]②[/font][font=Calibri]Taqman[/font][font=宋体]探针法[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Taqman[/font][font=宋体]探针是由[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]’端标记有荧光报告基团和[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]’端标记有淬灭基团以及与目标基因特异性结合的寡核苷酸序列组成。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，此时仪器不会检测到荧光信号。在[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增时，模板[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]变性解链，[/font][font=Calibri]Taqman[/font][font=宋体]探针特异性结合到目标基因处，而[/font][font=Calibri]Taq[/font][font=宋体]酶具有[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]’[/font][font=Calibri]-3[/font][font=宋体]’核酸外切酶活性，延伸至探针结合处，可将探针水解，使荧光报告基团和淬灭基团分离，从而检测到荧光信号，荧光信号的强度与扩增得到的[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]的浓度成正比。荧光信号被仪器检测并采集得到“扩增曲线”，通过荧光信号的强度反映出体系中[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]的浓度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Taqman[/font][font=宋体]探针法因其特异性高，被广泛地应用于等位基因鉴别、[/font][font=Calibri]SNP[/font][font=宋体]分型、病原体和病毒检测、疾病耐药基因研究、多重定量等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注[font=宋体]义翘神州[/font]qPCR定量分析服务：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/real-time-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-service[/font][/font][font=Calibri] [/font]

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    时间： 2024-01-08
    作者： 优云谱科技
  • 荧光定量PCR实验，荧光标记怎么选？
    荧光定量PCR技术是将常规的PCR和荧光检测技术相结合，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，以此实现对初始模板的定量分析。荧光定量PCR技术作为当今生物学研究的重要手段之一，在基础科学、生物技术、医学研究、法医学、诊断学等多方面具有广泛的应用前景。说到荧光定量PCR技术，我们经常会问类似于“你的实验是染料法还是探针法”，“你用的探针是什么类型”等之类的问题，这其实是对荧光标记的选择。根据荧光标记的不同，可以将荧光定量PCR实验分为探针法和染料法两大类。染料法染料法利用能与DNA双链结合的染料来实现，如SYBR Green I。该染料在游离状态下呈现微弱的荧光，一旦与双链DNA的双螺旋小沟结合，其绿色荧光增强约1000倍。因此其总的荧光强度与双链DNA含量成正比，利用这一关系可以反映生成的PCR产物的量（图 1）。SYBR Green I的最大吸收约在497 nm，发射波长最大约在520 nm，与FAM荧光分子的光谱性质类似，因此在所有的荧光定量PCR设备中都是第一通道检测，即“FAM/SYBR Green I”通道。▲ 图1 染料法原理图理论上，所有能与双链DNA结合的染料都可以用于qPCR检测，如溴化乙锭EtBr，碘化丙啶PI，吖啶橙、Cy3等。而选择用于qPCR反应的染料通常会从信号强度、生物安全性、检测简便性和经济适用性这几个因素考虑。例如EtBr可能存在潜在的致癌性。综合考虑下来，SYBR Green I成了比较理想的选择。目前，使用Evagreen的实验者也越来越多，Evagreen作为一种新型的染料，其光谱性质与SYBR Green I类似，其优势在于：▶ 对PCR反应的抑制程度小。高浓度SYBR Green I会强烈抑制PCR反应，因此要控制其使用浓度，一定程度上降低了DNA检测的灵敏度。▶ 与DNA结合密度高。单位长度的DNA双链上Evagreen的密度更高，为饱和型染料，消除了SYBR Green I存在的“染料重分布”的缺陷，提高检测灵敏度的同时也可用于高分辨率溶解曲线HRM。▶ 化学性质更稳定，适合长期保存。TaqMan 探针TaqMan 探针基本可以满足60%以上的qPCR实验，如常规的基因表达和拷贝数变异CNV实验。TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5' 末端，而淬灭剂则在3' 末端（图2）。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收 PCR扩增时, Tag酶的5' -3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。▲ 图2 Taqman探针MGB探针对于要分辨单碱基差异的SNP实验，采用对碱基错配容忍度更低的MGB探针，在淬灭基团后加入了DPI3基团（图3），从而提高了与靶标结合的亲和力；而且可以对靶点碱基进行化学修饰，如PeptideNucleic Acid和Locked Nucleic Acid。▲ 图3 MGB探针双杂交探针Taqman探针对探针的长度有比较严格的要求，双杂交探针则消除了这一“缺陷”。双杂交探针是由两条寡核苷酸单链组成，一条的3’端带有供体荧光分子，另一条的5’端带有受体荧光分子（图4）。游离状态下荧光供体会发出荧光，但当两条单链都匹配到模板链上时，就会发生荧光共振能量转移FRET，受体荧光分子就可以发出荧光，其荧光强度与生成的产物的量成正比。双杂交探针的优势有两点：摆脱了探针长度的限制，较长的探针可以提高与模板匹配的成功率；只有上下游两条探针都正确匹配后才能检测到受体荧光分子发出的荧光，特异性有所提高。▲ 图4 双杂交探针分子信标探针游离状态下，分子信标探针是一种茎环结构，其环状部分的15-30个碱基可以与靶标区域相结合匹配，下端的配对区域（左右一般各5-6个碱基）则由重复的GC组成，从而将5’的荧光分子和3’的淬灭基团紧紧聚在一起，荧光发生淬灭；当退火时，分子信标探针解开环并与模板靶标杂交，这样荧光分子和淬灭基团的物理距离就变大了，荧光淬灭的前提就打破了（图5）。除了MGB探针，分子信标探针也非常适合用于SNP检测。▲ 图5 分子信标探针除了上述几种类型的探针之外，还有尝试将引物和探针功能相结合的技术，如Amplifluor、LUX等，在设计难度上有所提高，但使用时更简便。各有其应用的侧重点和设计上的利弊，在此不多赘述。那么在荧光定量PCR实验中，我们应该如何进行选择呢？在这里，给大家总结了一些两种方法的区别，供大家参考。表1 染料法和探针法的区别
    时间： 2022-07-22
    作者： 艾普拜生物
  • 技术干货 | 实时荧光定量（qPCR）知多少
    实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。qPCR 原理将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。那在我们了解了qPCR的原理之后，我们接下来就要了解一下这几个我们在做实时荧光定量PCR的实验时，一定要清楚的知道的几个概念：CT值、扩增曲线、基线、荧光阈值和阈值循环数01Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。02扩增曲线（amplification curve）是在实时荧光定量PCR中监测到的荧光信号随着循环数变化而绘制的一条曲线。在进行PCR反应过程中，通过检测系统对PCR管内的样品进行实时检测，最后将荧光信号值通过成像技术显现在计算机上。正常的扩增曲线包括四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。03基线（baseline）是背景曲线的一段，在扩增反应的最初数个循环里荧光信号变化不大，接近一条直线。04荧光阈值（threshold）是在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准）。荧光阈值可以设定在PCR扩增的指数期。05阈值循环数表示每个PCR反应管内荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数，研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，CT值越小 起始拷贝数越少,CT值越大。我们利用已知起始拷贝数的标准品可做出以起始拷贝数的对数为横坐标,CT值为纵坐标的一条标准曲线。只要获得未知模板的CT值,即从标准曲线上计算出该模板的起始拷贝数。06荧光化学目前，实时荧光定量PCR技术主要通过两种方式——荧光染料或者荧光标记的探针对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，并结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。那我们要如何选择qPCR的检测方法呢？下面我就列出他们各自的优缺点，大家可以参考一下！ qPCR和常规PCR的区别实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高精确定量qPCR常见问题分析1.无Ct值出现检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。2. Ct值出现过晚（Ct38）扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。3. 标准曲线线性关系不佳加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。模板中存在抑制物，或模板浓度过高4. 负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。5. 扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。6. 溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。8. 扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解
    时间： 2021-08-20
    作者： 泽叶生物
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