属性测定

介绍清洁验证对于cGMP生产至关重要，用以确保产品质量和患者安全。总有机碳（TOC）检测是一种证明设备清洁度的合规方法。与专属性方法不同，TOC可以在提高工艺效率的同时提供对清洁度的全面了解。无论您是清洁验证的新手还是经验丰富的TOC分析仪用户，本文将为所有级别的人员介绍什么是清洁验证、如何以及为何要使用TOC方法进行清洁验证。清洁验证中的分析方法挑战典型的清洁验证（CV）计划包括三个阶段：01设计02验证03持续确认一个关键的行业挑战是如何选择最合适的分析方法来评估清洁验证（CV）不同阶段的已知和潜在残留物。例如，在早期设计阶段的工作中，关于最恶劣情况下化合物或其降解物清洁性的充分信息可能是未知的。这可能会给开发产品专属性的分析方法带来挑战，因为这些测试假定所有潜在干扰物都是已知的。同样，在验证阶段，产品专属性的分析方法可能不太有用，因为常见的残留物可能包括未表征的降解物或更难清洁的化合物，而不是目标活性药物成分（API，Active Pharmaceutical Ingredient）。最后，在持续确认阶段，包括产品切换、设备停机检修、成本在内的生产问题以及对持续或自动监测的需求可能会影响所使用的方法。清洁过程方法选择在许多情况下，清洁过程专属性方法，如总有机碳（TOC）分析（与产品专属性方法相比），可以在清洁验证程序的每个阶段非常准确地描述清洁工艺的总体有效性。关键的一点是，选择一种或多种方法取决于清洁过程后残留物的性质。如果在经过验证的清洁过程中，活性成分没有降解或溶解，并且充分了解所有干扰物，那么产品专属性方法（包括HPLC、UV/Vis或ELISA）可能是合适的。1，2常见的产品专属性分析方法以下产品专属性分析方法传统上一直用于清洁应用。所有这些都旨在确定特定化合物是否以其原始形式存在。高效液相色谱（HPLC）HPLC通过色谱法从基质中分离出独特的化合物，然后使用紫外线或其他检测器测量该化合物。优点：能够确定所含的特定残留化合物、可以提供有关清洁失败性质的数据挑战：假设化合物在清洁过程中没有降解、所有潜在的干扰物或残留化合物已充分了解、可能需要进行更多的方法开发酶联免疫吸附测定（ELISA）ELISA是使用特定化学品和标准品进行的抗原或抗体类反应。如果特定蛋白质是完整的并且存在于测试溶液中，它将与酶结合。然后这种结合会被检测到。然而，如果蛋白质已变性但仍存在于溶液中，则ELISA测试无法检测到变性的蛋白质含量。ELISA具有许多与HPLC相同的优势和挑战，但多用于生物制药生产。紫外/可见分光光度法（UV/Vis）UV/Vis是残留物溶剂溶液对特定波长光的检测或吸光度。优点：简单、不需要从基质中分离残留物挑战：不适用于所有化合物、来自其他吸光化合物的潜在干扰常见的过程专属性分析方法以下过程专属性（或非产品专属性）方法也普遍用于清洁应用。总有机碳（TOC）TOC方法氧化所有有机残留物并检测氧化产生的二氧化碳。优点：对包括降解物或非预期的化合物在内的所有水性有机化合物敏感、方法开发简单（单一方法）、适用于清洁验证的所有阶段挑战：非常适合于识别清洁验证过程的失败，但调查可能需要补充方法、化合物必须是水性的电导率电导率用于检测清洁淋洗水样品中的离子物质，最常用于检测最终冲洗过程中的微量酸性或碱性清洁剂。优点：易于自动化（在线）、对离子残留物极其敏感、方法开发简单（单一方法）挑战：仅适用于一部分化合物（清洁剂或离子 API）、仅适用于淋洗水样品其他分析方法除了清洁验证中常用的产品和过程专属性方法外，其他可供考虑的分析方法可能包括：目视检查用于检测生物残留物的生物负荷或内毒素用于快速分析特定目标化合物的离子迁移光谱检测酸性或碱性清洁剂的pH值使用红外方法（NIR/FTIR）原位识别表面残留物讨论对于清洁验证程序来说，选择合适的分析方法非常重要。分析方法应该能够充分确定一个经过验证的清洁过程是按照设计完成的，从而最大限度地降低产品污染的风险。在理想情况下，可以选择给定阶段（设计、验证、确认）的最佳分析方法。然而，在清洁验证的现实世界中，分析方法的选择可能会受到基于清洁过程和方法预期用途的实际考虑的限制。因此，更重要的是分析方法是否足够或合适，而不是为了达到预期目的而“认为”的最佳方法。2专属性和非专属性分析方法的比较清洁验证的专属性方法旨在检测相关的单一化合物，例如原料药（API）。这使得对设备清洁度的理解非常有限。可能存在降解产物、清洁剂、赋形剂或其他污染源，无法通过专属方法检测到。通过总有机碳（TOC）和电导率检测，可以对清洁度进行综合评估，从而自信地放行设备。从HPLC转变为TOC的清洁验证需要考虑的三个因素◆ ◆ ◆

安捷伦 AdvanceBio 色谱柱专注用于生物制药分析，当您分析高度复杂的生物药物分子需要监控其纯度及关键质量属性，本章将为您讲述关键质量属性中的肽图分析和糖基化分析。肽谱分析 — 特异性地鉴定和定位修饰的唯一方法与先前讨论的 PTM 检测方法相比，肽谱分析是可以通过 LC/MS/MS 特异性地鉴定和定位修饰的唯一方法。肽谱分析主要用于检测目标蛋白的序列变异，但也越来越多地作为多属性方法( MAM ) 的一部分，用于同时定量 PTM，如氧化、脱酰胺基化、糖基化和异构化。在图 1 中，我们可以看到肽谱分析显示创新药物和生物仿制药 mAb 之间差异的示例。图 1. LC/MS 总离子色谱图显示了创新药和生物仿制药产品肽谱的差异。 突出显示的差异由 C 端赖氨酸截短引起MS/MS 实验表明，差异是由 C 端赖氨酸截短引起的。尽管样品前处理（还原、酶解和纯化蛋白质样品）过程较为复杂，但肽谱分析可以从单个实验中提供关于多个CQA 的大部分信息。在转移到 LC/UV 进行 QA/QC 之前，肽谱分析在蛋白质表征阶段严重依赖于 MS 检测。只进行紫外检测的情况下，无法确信已经建立了完整的肽谱图。精确质量数测定，通过 MS/MS 进行序列确认和 PTM 定位，对真实地表征蛋白质和鉴定关键质量属性非常必要。肽谱分析的局限性包括：相对较低的通量（液相色谱方法通常需要一个小时或更长的时间）、色谱柱化学键合相的选择（能在保持 MS 分析灵敏度的同时拥有最大的色谱分离度）、如何获得较宽的动态范围以及如何应对修饰和未修饰肽的化学多样性。糖基化分析—研究工具那么多，选哪个？糖链是修饰的异质性中独有的 PTM。由于糖链在细胞信号转导中具有重要作用并且可以影响蛋白质构象，糖链结构的变异可能会导致有效性和安全性的改变。蛋白质上的糖基化位点和糖链结构本身对表征都非常重要，可以用来分析多种样品类型，如完整蛋白质、糖肽和释放后的糖链。适用糖肽分析的研究工具由于糖链仅占完整蛋白质相对小的一部分，因此通常情况下色谱分离几乎不会提供完整蛋白质糖基化状态的信息。而对此最重要的例外是使用离子交换测量唾液酸糖链。但是，质谱可以准确地测量高水平的糖基化，并且可以进行相对定量分析。当与反相分离相结合时，可以评估蛋白质纯度和糖基化状态。对于这些完整蛋白质水平的方法需要注意的是，它们无法测定具体的位点修饰。释放后的糖链分析通常通过 HILIC 分离标记糖链结合荧光检测来实现。通常情况下，在将方法转移到 LC 荧光之前，会进行 MS 检测方法开发以确认峰归属。尽管 MS 确实比光学检测提供了更具体的信息，但糖链的结构表征仍然存在较大的问题。MS/MS 技术创新对糖基化分析做出了重大贡献，电子迁移裂解 ( ETD ) 等基于电子的技术可以产生比更成熟的碰撞诱导解离 ( CID )表现出的碎裂模式更为丰富的穿环裂解。糖肽分析很大程度上也依赖于 MS/MS，但糖肽不适合 HILIC 或反相分离。糖肽比大多数非糖基化肽更具亲水性，因此在用于肽谱分析的反相色谱柱上对其进行保留和分离具有很大挑战性。然而，糖肽的肽段基团常使它们难以通过 HILIC 进行保留和分离。混合模式色谱和二维液相色谱组合是可用于糖肽表征的研究工具。类似于糖肽引起的分离问题，肽段由 CID 充分而可预测（更重要）地进行碎裂，而如上所述，ETD 能给出更有帮助的糖链碎片。混合 ETD/CID 技术是未知糖肽表征的前沿技术。法规越来越严格，怎么办？生物固有的含水性使液相技术在生物治疗药物的 CQA 分析中占据主导地位。LC/UV 是 CQA 分析的重要基础，因成本不高、所需用户专业知识不多，这项技术的预计使用不会很快减少。然而，随着法规要求越来越严格，生物治疗药物变得越来越复杂，光散射和 MS 等可以提供更多信息和更高可信度的技术越来越受到青睐。由于效益与成本的比率以及所需技能的提高，这些技术一旦在生物制药公司的早期研究阶段和表征环境中应用后，便逐渐进入下游 QA/QC 环境中。前沿方向多属性方法 ( MAM ) 是 CQA 监测的一个备受关注的方向，因为可将多达六种分析方法整合到一种 LC/MS/MS 方法中。除了上述肽谱分析讨论中提到的 PTM 外，它还可以用于测量工艺杂质，如宿主细胞蛋白质。虽然高分辨质谱仪可能具有需要投资和大量的专业知识的缺点，但通过单次分析鉴定蛋白质、测量序列变异、片段、电荷异构体、糖链、其他 PTM 和工艺杂质可节省时间和成本，因此是一个值得关注的机会。“关键质量属性”系列文章就到这里啦，如果您对这个领域感兴趣，欢迎扫描下方二维码关注“安捷伦视界”微信平台，未来我们将为您送上更多精彩内容。本文仅限研究使用。不可用于诊断目的 。

关键质量属性（CQA）是生物学特征，会影响安全性和有效性，必须得到密切监测，因此需要使用各种分析技术对分子进行大量测试。定义太空洞？当我们在谈论关键质量属性时我们在谈论什么？今天来谈谈滴度测定和电荷异构体分析。CQA 检测中，除了聚集体分析至关重要之外，滴度测定和电荷异构体分析也分别起到不同的作用。滴度测定滴度测定虽然不直接测量 CQA，但常作为生物治疗蛋白生产的第一步质量检查。异常滴度可反映细胞株或培养基存在的问题，这些问题可能会导致异质性或产品出错而不仅是降低产率。使用 UV 检测的 Protein A 亲和捕获色谱是生物制药中用于单克隆抗体 ( mAb )滴度测定的一种普遍方法。许多实验室选择基因修饰的重组 Protein A 平台，因为重组蛋白质通常更稳定，有更长的色谱柱寿命。天然（纯化）Protein A 的吸引力在于对某些 IgG 具有更紧密的结合亲和性。Protein A 产品可用作预装填柱、整体床柱和供用户填装使用的松散介质。整体床色谱柱具有更大孔径的筛板，因此不易堵塞，对复杂样品基质更加耐用。异常滴度可能需要分析用过的细胞培养基，以排除低产量的原因。氨基酸是培养基的主要成分，可以通过多种技术进行分析，最常见的是利用 LC/UV 分析衍生化氨基酸。衍生化技术的优点是可以广泛应用，并可通过反应化学引入一定程度的特异性，但是人们对分析未衍生化氨基酸以最大限度缩短样品前处理时间也越来越感兴趣。未衍生化氨基酸不具有 UV 吸收，因此需要用到其他检测器，如蒸发光散射( ELSD ) 或质谱 ( MS ) 检测器。然而，ELSD 的灵敏度不够高，仅能达到低纳摩尔水平，而衍生化氨基酸的 UV 检测可以达到低皮摩尔水平。MS 分析检测也能得到更高的灵敏度，在数量级上实现提升。虽然MS 仪器的成本一直是此方法广泛使用的阻碍，但其引发的越来越广泛的关注已经使供应商开始在市场中引入经济实惠且切合实际需求的质谱仪。随着 MS 更广泛的使用，快速有效地分离分子量较小的极性分子成为一个需要克服的挑战。使用反相色谱柱分析离子对可得到非常稳定的结果，但需要专用仪器。过去， 亲水相互作用色谱 ( HILIC ) 一直在努力满足市场对稳定性和重现性的要求，而最近推出的色谱柱在这方面已经有了重大改进。电荷异构体分析使用 UV 检测的离子交换色谱 ( IEX ) 常用于分离由 PTM（如赖氨酸截短、脱酰胺或唾液酸化）产生的电荷异构体。此项分析通常也在完整蛋白质水平上进行，因为这种变化可以被检测到，但无法进行特定的鉴定和定位，IEX 通常使用盐梯度来进行，这些高浓度的非挥发性盐不适用于 MS。因此，一个新的关注点是使用 pH 梯度而非盐梯度，这样便可以使用低浓度且可以有效挥发的缓冲盐流动相，以便和 MS 联用。为了保留样品，IEX 要求样品具有与固定相相反的极性电荷。盐梯度 IEX 使用高浓度盐来破坏这些离子的相互作用并洗脱分析物。pH 梯度必须跨越分析物的等电点 ( pI )，以便蛋白质在电中性时被洗脱。尽管线性 pH 梯度难以重现，但 pH 梯度可以将分析物聚集到较窄的谱带中，从而获得比盐梯度更高的分离度。由于必须非常精确地控制并适当地选择流动相 pH、离子强度和梯度组分，可靠的 IEX 方法开发具有挑战性。通常需要进行大量的方法开发，但可以利用软件来筛选仅由少量储备液制备的复合缓冲系统的梯度，从而简化方法开发。毛细管等电聚焦 ( cIEF ) 也常用于电荷异构体分析。类似于 pH 梯度 IEX，cIEF 也是基于 pI 进行蛋白质异构体分离，是一项验证 IEX 结果的常用技术。