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秋水仙碱类生物碱的质谱裂解规律探究摘要:采用气相色谱质谱(GC/MS)研究了八种秋水仙碱类生物碱化合物的质谱裂解途径和机理。发现部分碎片离子一致,其主要的裂解途径是通过四元环过渡态氢重排失去侧链生成离子m/z340,由于结构中的七元环上有羰基,而七元环相对来讲没有六元环稳定,所以其会进一步失去羰基的CO生成离子m/z 312,保持了较高的稳定性,所以在质谱图上表现出较高的丰度,同时化合物还通过失去甲氧基自由基及甲基自由基得到其他对应的碎片离子峰。关键词:秋水仙碱;裂解规律;气质联用;生物碱秋水仙碱类生物碱是一类很重要的有机化合物,秋水仙碱是1820年于百合科植物秋水仙中发现的一种重要的卓酚酮类生物碱(1)。由于秋水仙碱及其类似物的特殊生理活性和药用价值,它们一直受到广泛的关注。因其特殊的结构和强抗癌活性,近几年有关秋水仙碱作用机制的研究异常活跃。临床上常作为痛风性关节炎急性发作和某些癌症治疗的首选药(2-5)。当秋水仙碱的摄入量过多将会导致死亡,所以也受到司法鉴定的关注。同时秋水仙碱在生物学上更重要的用途是作为多倍体诱导剂诱导多倍体的发生(6-10)。目前关于秋水仙碱的检测方法已有较多报道(11-14)。色谱质谱法由于其特异性,具有较好的分离度以及较高的灵敏度且能提供更多的样品信息而被广泛应用,对于生物碱类化合物的质谱裂解规律及机理已有较多的文献报道(15-21)。而关于秋水仙碱类生物碱的质谱裂解机理和规律还未见相关报道,电子轰击离子源由于具有较高的电离能,能够获得更加丰富的质谱信息而被广泛应用,所以本文通过气相色谱质谱联用法对多种秋水仙碱类化合物在电子轰击离子源下的质谱裂解途径和规律做以阐释总结,旨在为此类化合物的组分鉴定,结构确认提供理论指导依据。1试验部分1.1 仪器与试剂GCMS-QP2010UItra(日本Shimadzu公司);Demecolcine、Deacetylcolchicine、2-Demethylthiodemecolcine、N-Butoxycarbonyldemecolcine、N-Deacetylisocolchicine、N-Acetylcolchamine、N-Trifluoroacetyldemecolcine标准品2.2 仪器条件1.2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent DB-1MS弹性石英毛细管柱(30m*0.32mm*0.25um);载气:He(纯度99.999%);恒压模式:48.0kPa;初始温度100℃,以10℃/min的速率升至300℃恒温10min;分流进样,分流比10:1;进样量0.2ul,进样口温度300℃,接口温度300℃。1.2.2 质谱条件 离子化方式:EI(电子轰击离子源),离子化电压70ev,离子源温度250℃,离子扫描范围:m/z 32~600。1.2 实验方法称取0.25mg标准品用1ml甲苯溶解,分别进行GC/MS全扫描,获得八种化合物EI离子源下的质谱图。八种化合物及其对应的质谱图如下:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508211541_562003_2359621_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508211541_562004_2359621_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508211541_562005_2359621_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508211541_562006_2359621_3.jpg2 结果与讨论2.1 Deacetylcolchicine的质谱裂解途径去乙酰秋水仙碱Deacetylcolchicine的质谱图见图Fig.i,谱图中基峰为分子离子峰m/z 357,表明其分子结构具有较高的稳定性。谱图中有明显的m/z 340碎片离子,其生成是由于氨基具有较强的质子亲合能,β位的氢通过四元环过渡态重排到氨基上,然后脱去中性分子NH3,两个孤电子成对生成烯键得到碎片离子m/z 340。由于分子结构中具有环庚三烯酮结构,所以其可以发生进一步的裂解失去CO中性分子,而形成六元环稳定结构,得到碎片离子m/z 312,为奇电子离子,具有较高的丰度。由分子离子峰可直接失去CO中性分子得到碎片离子m/z 329,当苯环上的一对π电子被电离后,离子m/z 329可以发生α断裂,失去甲基自由基,得到离子m/z 314,该离子通过氢过渡态重排失去NH3得到离子m/z 297(其生成也有可能是m/z 312失去甲基自由基)。该离子失去中性分子CO后生成离子m/z 269,该离子再失去甲基自由基后得到碎片离子m/z 254,该离子可进一步失去甲基自由基生成离子m/z 239,后失去一分子CO得到离子m/z 211,再失去一分子CO得到离子m/z 183。游离基中心定域在氨基上,游离基中心孤电子强的配对倾向诱导发生α断裂失去氢自由基得到碎片离子m/z 328。由分子离子峰可以失去甲氧基得到碎片离子m/z 326,该离子进一步失去CO得到离子m/z 298具有较高的丰度,后失去甲基自由基生成离子m/z 281。可能的质谱裂解途径见Fig. 1http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508211451_561952_2359621_3.jpg图1 Deacetylcolchicine的质谱裂解可能的质谱裂解途径Fig. 1 Possible cleavage pathways of Deacetylcolchicine2.2 N-Deacetylisocolchicine的质谱裂解途径去乙酰异秋水仙碱N-Deacetylisocolchicine的质谱图见图Fig.ii,其结构上与去乙酰秋水仙碱有细微的差异,仅是甲氧基取代基与羰基的位置发生了互换,其质谱图中基峰为分子离子峰m/z 357,分子离子峰失去甲基自由基,生成碎片离子m/z 342,该碎片离子失去中性分子CO后生成离子m/z 314,后通过四元环过渡态β位氢重排失去小分子NH3生成离子m/z 297,由分子离子失去中性分子CO后生成离子m/z 329,当游离基中心定域在氨基上自由基强烈的配对倾向诱导发生α断裂失去氢自由基生成碎片离子m/z 328。由分子离子还可直接失去甲氧基自由基生成碎片离子m/z 326,其可以失去CO得到离子m/z 298,具有较高丰度,分子内氢重排失去甲醛后生成离子m/z 268。当分子离子经过四元环过渡态氢重排后失去NH3可生成离子m/z340,该离子进一步裂解失去CO中性分子得到离子m/z 312,稳定的六元环结构提高了离子的稳定性,所以具有较高的丰度,该离子失去甲氧基后生成离子m/z 281,可进一步裂解得到离子m/z 266,或者通过氢重排失去甲醛生成离子m/z 282,可进一步裂解生成离子m/z 267。m/z 312亦可失去甲基自由基得到离子m/z
药品标准是药品检验必须遵循的法定依据,是药品生产的法定技术准绳,并对临床用药发挥重要的指导作用。国务院食品药品监督管理部门设置的药典委员会负责药品质量标准的制定和修订。1. 采用和执行药品质量标准的现状药品质量标准主要分为《中华人民共和国药典》及其增补本;国务院药品监督管理部门颁布的国家药品标准(包括国家食品药品监督管理局药品注册批件或修订件);卫生部药品标准;药品注册标准;国家食品药品监督管理局药品检验补充方法和检验项目批准件等;省级中药材标准;省级中药饮片炮制规范;医疗机构制剂标准等。按照《药品管理法》第六条的规定,我国市(地)以上药品检验所承担着对上市药品质量的监督抽验任务。以北京为例,中国药品生物制品检验所和北京市药品检验所主要承担着药品的注册检验、进口药品的检验、生物制品和全国评价性药品的检验;大量的上市后药品的监督抽验主要由各区县所负责。以下谈谈采用和执行药品质量标准的现状。1.1药品质量标准难求 无论是从版本上还是从分类上,现行的药品质量标准都是一个庞大的标准库。对于每年颁发的新药和仿制药品标准、试行标准等,有关部门只将标准发送到研制单位和当地省级食品药品监督管理部门和省级药品检验所,基层药检所很难得到。笔者所在的北京市区级中心药品检验所在日常工作中经常遇到查找和索取药品标准的情况。为了履行自己的检验职责,基层所要自己向相关单位索取药品标准。但是能否及时要到标准,要来的标准是否就是真实有效的,基层药检所本身由于自身权限的局限,已经无能为力了。这种局面的长期存在对公众的用药安全构成潜在的风险。1.2检验方法参差不齐目前,国内不同药品生产企业生产的同一种药品,执行不同的药品标准的现象比较普遍,甚至有同一生产企业生产的同一种药品仅因为规格不同,执行的药品标准也有不同。对于同一种药品,有时检验的项目和参数不同;有时项目一样,具体的检验方法又不同。例如常用的OTC药品—健胃消食类制剂,尽管《中国药典》收录有健胃消食片,可是由于规格的改变或者生产厂家的不同,可能具体执行的就是单页标准。又如常用的抗感冒药复方氨酚烷胺类制剂,不同厂家做含量测定时,有的采用的是传统的化学滴定,有的采用高效液相色谱法。这会导致同一个名称的上市药品其内在质量其实各异,对于患者来说,很难获得同一的疗效和安全保障。1.3标准针对性待商榷例如,(1)中成药中非法添加西药是近年来打击的重点。有关部门也专门汇编了部分厂家部分品种的补充检验方法,所用的仪器相当一部分是液相色谱-质谱联用设备。目前,在北京地区的18个区县所中没有一家有该设备。即使遇到患者举报有类似情况时,我们就无能为力了。唯一的办法就是交给省(直辖市)药检所来做。(2)地高辛片是《中国药典》收录的品种,其质量标准项下既采用高效液相色谱法测定了含量均匀度,同时又采用高效液相色谱法测定含量。又如在很多中成药质量标准中既用HPLC法测定了某种成分的含量,又用TLC法做鉴别。这些检验项目单个来看,都是无可厚非的。但联合起来看则有重复检验的嫌疑。为了节约检验成本,同时也为了尽可能地实现低碳和环保的目的,不必过分追求检验项目的多和全。(3)新版《中国药典》中微生物限度采用方法验证试验,这在基层药检所的实际工作中不太适用,开展起来很困难。到目前为止,每年很少有检品做该项检验。2.对策