人肾上腺神经母细胞瘤细胞

1947年，Mandel和Metais首次报道了外周血中存在游离DNA（Cell-free DNA, cfDNA）。正常生理状态下，血液中的cfDNA主要来源于白细胞的坏死和凋亡；在某些疾病和特殊状态下，如组织损伤、癌症和炎症反应等，细胞内的DNA片段也会被释放到各种体液中（血浆、脑脊液、尿液等）成为cfDNA。在癌症早期，当患者还未表现出明显的临床症状时，细胞内DNA状态就已经发生变化，这些DNA被释放到体液中，使得体液cfDNA中包含了与癌症相关的重要信息。通过对这些信息进行提取和处理，可对癌症进行非侵入式诊断，实现癌症的早期诊疗，因此，cfDNA检测是目前市场上最常见的液体活检形式。髓母细胞瘤（Medulloblastoma，MB）是一种恶性的儿童胚胎中枢神经系统肿瘤，具有沿软脑膜转移的倾向。根据基因组特征可分为4个亚群：WNT、SHH、 Group 3和Group 4。手术切除结合放化疗是目前治疗MB的首选治疗方案（可治疗约70%的病人），术后的标本则作为诊断和肿瘤特征分析的证据。MB能够随着时间的推移而发展，约1/3患有MB的儿童最终都是死于该疾病，存活下来的患者也需要长期忍受由于治疗而产生的毒性。目前，除了磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）和脑脊液（Cerebrospinal fluid, CSF）细胞学检测，还没有可靠的分子生物标志物来反应MB的进展情况。因此，通过纵向样本开发强大的、微创的、临床可操作的生物标志物是非常必要的。研究显示，在 CNS 恶性肿瘤患者中，CSF来源的cfDNA比从血浆中分离出来的cfDNA具有更大的效用【1-2】。MB基因组几乎没有热点驱动突变，而是以普遍的染色体拷贝数变异（Copy number variations, CNVs）为特征，因此限制了cfDNA 突变分析在MB中的通用性【2-3】。近日，来自美国St. Jude儿童研究医院的Paul A. Northcott团队在Cancer Cell杂志在线发表了题为Serial assessment of measurable residual disease in medulloblastoma liquid biopsies的文章。研究人员利用MB中染色体不稳定性的特点，通过低深度全基因组测序（Low-coverage whole-genome sequencing, Lc-WGS）对来自123名MB患者的476例CSF来源的cfDNA样本进行分析，鉴定了可作为可测量残留病变（Measurable Residual Disease, MRD）标志物的CNVs，阐释了cfDNA检测的疾病预测价值和诊断价值。本研究共收集了来自123名MB患者的共476例CSF样本，提取cfDNA进行低深度全基因组测序（lcWGS），并进行后续分析（图1）。首先，作者评估了cfDNA来源的CNVs作为MRD标志物的效用。数据显示，在67例样本（67/105）中检测到了MRD；相反，7例非肿瘤CSF样本中都没有检测到cfDNA来源的CNVs，即MRD阴性。MRD阳性CSF样本与相应的原发性肿瘤之间的CNVs检测谱高度一致。MRD检测与疾病的转移状态、分子亚群和肿瘤位置显著相关，与年龄、性别、切除范围、细胞学检查结果以及切除和脑脊液取样之间的时间无关。值得注意的是，无论相应的脑脊液细胞学结果如何，MRD在高危疾病患者中的阳性率相似：91例脑脊液细胞学阴性的样本中有56例样本的MRD呈阳性。图1. 样品收集及检测流程图随后，作者探究了连续MRD检测与疾病复发之间的关系。在30/77（39%）例放疗后、21/75（28%）例化疗中及20/68（34%）例治疗结束的患者中检测到MRD。出现疾病复发的患者在治疗期间的MRD持续率明显高于没有复发的患者。在MRI显示病情完全缓解的32例病人中，有16例病人在复发前3个月时就检测到了MRD，此时影像学或细胞学异常还不能检测到。在所有持续接受放化疗或细胞学有差异的12例病人的CSF样本（n=27）中均检测到了MRD。24/25例患者在病情发展的3个月内采集的脑脊液标本中MRD呈阳性；在病情没有进展的患者中，193/209（92%）例CSF样本都是MRD阴性。那么，连续检测MRD在临床上有何价值？作者发现，那些放化疗后、治疗期间或已经结束治疗的病人中，MRD阳性病人的无进展生存期（progression-free survival, PFS）比MRD阴性的病人差很多。与治疗结束时MRI和脑脊液细胞学检查的标准评价进行比较，同时进行的MRD检测对于病人分类更有效，其对残留病变的灵敏度也更高（64% vs. 24%）。在治疗结束的病人中，12/20（60%）MRD-阳性的病人的MRI/细胞学检查正常，但后期其中的10位病人的病情都有所进展；其余两例病人MRI正常其MRD也呈阳性。在高风险患者中，治疗结束时的MRD与PFS有显著关系。作为一个随时间变化的变量，随访期间MRD检测与PFS显著相关。接下来，作者对疾病复发中的肿瘤相关分子图谱进行了分析。为了同时在早期和疾病进展期检测渐进性疾病（Progressive disease, PD）和MRD阳性患者的CSF，作者比较了从患者匹配的CSF样本中提取的CNVs谱，发现了染色体非整倍性，提示12/15（80%）例患者存在克隆选择或进化。cfDNA 分析可以更早地检测出那些在疾病复发时占主导地位的肿瘤克隆。在研究过程中，作者也注意到了原位肿瘤与cfDNA中检测到的CNVs不一致的情况。例如，患者sj024被诊断为Group4髓母细胞瘤，随后又出现转移性骨骼复发。然而与相应的原位肿瘤CNV检测结果相比，患者的cfDNA来源的CNVs谱更符合复发肿瘤特性，提示患者的CSF样本中包含了具有侵略性的亚克隆，可以驱动疾病的进展。最后，作者进一步评估了基于 lcWGS 的 cfDNA 分析在其他儿童脑肿瘤中的适用性。通过对17名非髓母细胞瘤患者进行分析，发现所有患者在其相应的原发肿瘤中都存在染色体和/或局灶性CNVs。基于lcWGS分析CSF来源cfDNA显示，13例（76%）样本呈MRD阳性，包括3例转移样本。此外，作者还观察了与临床过程相呼应的cfDNA样本的分子反应，其与MB中的发现类似。综上所述，该研究利用从MB和其他CNS肿瘤患者收集的脑脊液样本的大型纵向队列，首次有效地、系统地论证了CSF来源的cfDNA谱在儿童CNS癌症中检测MRD的临床效用（图2）。虽然液体活检的种类和方式非常丰富，但作者认为使用lcWGS检测CSF来源的cfDNA中的肿瘤相关CNVs非常适合于MB：（1）MB切除后患者脑脊液或血浆中cfDNA的含量明显低于其他脑肿瘤患者【4-5】，这种低于毫微克的产物，若采用其他检测方法（如表观遗传组和突变分析）是极具挑战的，但对lcWGS已经足够；（2）染色体CNVs在儿童MB中几乎无处不在，捕获CNVs无需使用定制探针来靶向不同的突变驱动基因，适用于缺乏已知驱动基因突变的MB样本。该研究支持将前瞻性cfDNA评估纳入MB临床试验，以进行进一步的研究和技术改进，最终实现根据MRD反应进行个性化治疗。图2. cfDNA检测流程及临床效用原文链接:https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.09.012

通过交叉科学研究，提出并发展生物医学前沿新技术，是提高重大疾病治疗效果的重要手段。胶质瘤是发病率和死亡率最高的中枢神经系统肿瘤，其中胶质母细胞瘤（GBM）是最恶性的肿瘤，也被称为“癌中之王”。临床上治疗GBM以外科手术为主，同时辅助放化疗，但是效果非常有限；以手术和替莫唑胺联合治疗为例，5年生存率小于5%。因此，亟需开发新型高效的GBM治疗策略。 GMB治疗棘手的原因主要有三方面。首先， 血脑屏障（BBB） 的存在阻止了药物进入中枢神经系统，需要发展更有效的药物递送策略；其次，单一化疗药物的使用易导致耐药性的产生，需要联合新的肿瘤杀伤手段；另外，GBM具有复杂的肿瘤微环境，对其快速生长和向周围组织的浸润起到重要作用，在治疗的过程中不容忽视。 近日，中科院过程工程所生化工程国家重点实验室 魏炜 研究员、 马光辉 院士、深圳市第二人民医院 李维平 教授，作为共同通讯作者 在 Signal Transduction and Targeted Therapy 期刊发表了题为： Exploration and functionalization of M1-macrophage extracellular vesicles for effective accumulation in glioblastoma and strong synergistic therapeutic effects 的研究论文。 该研究基于工程化细胞外囊泡发展了“ 免疫调控-化学动力-乏氧激活 ”多级联动的治疗新策略，为胶质母细胞瘤的治疗带来了新思路。针对胶质母细胞瘤治疗难题，过程工程所生化工程国家重点实验室基于具有定向趋化能力的巨噬细胞的细胞外囊泡 （EVs） 和工程化的设计，提出了“免疫调控-化学动力-乏氧激活”多级联动的治疗新策略，并联合深圳市第二人民医院交叉合作，进行了个体化创新药物制剂的研发。 研究团队首先基于胶质瘤患者的临床样本和小鼠模型进行了免疫组化的研究，发现胶质瘤恶性程度越高，肿瘤组织中浸润的M2型巨噬细胞/M1型巨噬细胞的比例也相应更高，并且这些巨噬细胞大多来源于外周血。在此基础上，研究团队提出了以M1巨噬细胞EVs作为载体，一方面可以利用M1巨噬细胞的趋化特性在GBM部位大量蓄积，另一方面可以通过调控巨噬细胞表型实现GBM微环境的免疫调控。图1 胶质瘤样本中巨噬细胞的表型及其来源分析：a. 胶质瘤患者临床样本中巨噬细胞表型分析示意图；b. 不同级别胶质瘤中M1、M2和Ki67（细胞增殖指标）的分析；c. 基于TCGA数据库分析不同级别胶质瘤中M2/M1比例；d. 基于TCGA数据库分析胶质瘤患者瘤内M2/M1比例与生存曲线的关系；e. GBM组织中小胶质细胞和M1巨噬细胞的共定位分析；f. 免疫荧光染色分析GBM组织中小胶质细胞和M2巨噬细胞的共定位；g. 小鼠胶质瘤样本中巨噬细胞表型分析示意图；h. 在不同胶质瘤细胞系（U87MG、G422和GL261）中M1、M2和Ki67的分析；i. 免疫荧光染色分析不同鼠胶质瘤组织中小胶质细胞和M1或M2巨噬细胞的共定位情况；图中标尺均为50 μm 研究团队进一步在M1EVs的细胞膜和内腔差异化装载了化学激发分子对 （CPPO和Ce6） 以及乏氧药物 （AQ4N） ，以此将肿瘤微环境调控、化学激发动力学及肿瘤乏氧治疗合理有序地集成于M1EVs递送系统中。上述仿生剂型 （CCA-M1EVs） 静脉注射后，M1EVs可以携带上述组分穿过BBB进入GBM病灶，进而实现多级联动治疗：M1EVs调控免疫微环境产生大量过氧化氢，从而激发CPPO和Ce6生成自由基 （ROS） ，同时该反应消耗氧气激活细胞毒性药物AQ4N。借助上述作用的协同，在小鼠原位胶质瘤模型和患者来源的 （PDX） 模型上显著抑制了疾病的进程，大幅延长了生存期。图2 基于M1EVs的仿生剂型构建方案、抗肿瘤机制及PDX疗效：a. 仿生剂型的构建示意图；b. 仿生剂型在GBM模型中的累积及免疫调节、化学激发动力学和乏氧触发化疗的协同作用示意图；c. 基于光声成像分析仿生剂型在PDX小鼠GBM病灶中的累积；d. 各组PDX小鼠的抑瘤效果（20天核磁成像）；e. 各组PDX小鼠的生存期分析；f. 各组PDX小鼠的TUNEL分析（标尺50 μm） 十余年来，过程工程所生化室魏炜研究员和马光辉院士创制了一系列仿生递送新剂型，利用其体内的天然路径和属性，在动物模型上成功用于肿瘤、传染病、炎症性疾病的防治，并且部分剂型已通过医院伦理批准进入个体化临床前和临床研究。 深圳市第二人民医院 王晓君 博士和丁辉博士为该论文的共同第一作者，中科院过程工程所生化工程国家重点实验室魏炜研究员、马光辉院士和深圳市第二人民医院李维平教授为共同通讯作者。论文链接 ： https://www.nature.com/articles/s41392-022-00894-3

个法国研究团队评估了替莫唑胺为基础化放疗添加伊立替康和贝伐珠单抗可否改善不可切除胶质母细胞瘤患者的预后。ESMO 2012期间，B. Chauffert博士报告了该研究结果：患者无进展生存（PFS）有改善趋势。　　这项Ⅱ随机研究共纳入了120例18～70岁的新发不可切除胶质母细胞瘤患者。患者卡诺夫斯基体能状态评分＞50分，递归分割分析（recursive partitioning analysis ，RPA）5级。患者被随机分组，每组60例，接受4个周新辅助贝伐珠单抗和伊立替康治疗，继以替莫唑胺和贝伐珠单抗同步放疗，或者接受6个月的替莫唑胺同步放疗。　　临床因素组间平衡性良好，疾病进展后可交叉治疗。治疗16个月时的评估显示，治疗组较对照组PFS期延长，6、12个月时的PFS率分别为65%、31%和41%、18%。但是，两组的总生存（OS）相似，6、12个月的OS率分别为75%、48%和72%和50%。　　治疗相关严重不良事件发生情况如下：治疗组中，致命性脑出血3例，胆管或消化道穿孔/感染3例（1例致命），非致命性血栓栓塞发作4例；对照组中，非致命性胆管或消化道穿孔/出血2例，非致命性肺部感染1例，非致命性血栓栓塞2例，血栓和/或中性粒细胞减少症4例。　　研究者作出结论：替莫唑胺为基础化放疗添加伊立替康和贝伐珠单抗新辅助和辅助治疗有改善PFS的趋势，但不改善6和12个月OS。