丁烷磺酸钠离子对色谱级

离子对试剂：极性药物分析绕不开的话题 液相色谱是药物杂质含量测定和有关物质分离分析最常用的技术手段。对一个陌生的化合物，ODS反相色谱柱通常方法开发条件会选择酸性pH流动相。然而，总有些化合物，它们或含氨基、或含羧基、磺酸基团、磷酸基团，极性较强在反相色谱柱上没有保留。打开2020版《中国药典》第二部，不难发现这些品种，名称中常含有“马拉酸”、“盐酸”、“碱”、“酸”等关键词。对于这类强极性化合物的分析，药典给出的答案是：流动相中添加离子对试剂。例如丁溴东莨菪碱、贝敏伪麻的有关物质流动相条件中含有十二烷基硫酸钠；马来酸曲美布汀的流动相含有戊烷磺酸钠；盐酸头孢吡肟的流动相含有辛烷磺酸钠；叶酸、头孢美唑和对氨基水杨酸钠的流动相含有四丁基氢氧化铵。离子对试剂的添加，增强了极性化合物的保留，改善了药物与杂质的分离，是极性药物分析的杀手锏。 离子对试剂：“质谱不能承受之重” 辛烷磺酸钠和四丁基硫酸氢铵等常用离子对试剂，属于不挥发盐类，质谱响应强且信号经久不衰，持续抑制目标化合物的电离。一旦误操作进入质谱端，需要清洗整个离子通路才能恢复质谱的正常状态。常规二维液相在线除盐系统仅能去除无机盐，无法去除离子对试剂。这是因为无机盐（如磷酸盐）在二维反相色谱柱上无保留，在死时间将其切至废液从而实现在线除盐。然而离子对试剂具有较强的疏水性，在常规ODS色谱柱上强烈吸附显著拖尾，因此不能被常规二维液相系统去除。 上图是辛烷磺酸钠在ESI离子源上的响应。可生成簇离子，质谱响应强且持久，对ESI正负模式均可产生抑制。 上图是四丁基硫酸氢铵在ESI离子源正模式的响应，质谱响应强且持久。四丁基硫酸氢铵与固定相强烈作用，色谱上呈现显著拖尾。 ReDual:一款可以同时分离无机、有机、阴、阳离子的“神柱” ReDual系列色谱柱，是岛津公司最新推出的离子交换反相混合键合相色谱柱，共分为三款： ReDual™ SCX-C18 强阳离子交换+反相ReDual™ CX-C18 弱阳离子交换+反相ReDual™ AX-C18 强阴离子交换+反相 下图是采用ReDual AX-C18 (4.6 mm I. D. × 150 mm L., 5 µm，货号426-45415)分析磷酸二氢钠、四丁基硫酸氢铵和卡络磺钠混合样品的色谱图。该款色谱柱表面键合叔胺基团，在pH 2-7范围内色谱柱表面带阳离子。除疏水作用外，其对阴离子具有离子交换作用，对阳离子具有离子排斥作用。为分离极性类似的阳离子和阴离子型化合物提供了条件。下图中四丁基氨根离子峰型对称，不拖尾无残留，可以通过阀切换导入废液实现在线去除。 ReDual AX-C18色谱柱NQAD检测器同时分离无机有机阴阳离子（1：Na+ 2：四丁基氨根离子；3：H2PO3- 4：卡络磺酸根离子） 应用案例：卡络磺钠参比制剂中杂质结构鉴定 本应用采用常规中心切割二维液相系统，无需改造仪器；馏分转移过程配有紫外检测器监控，不存在检测盲区；离子对试剂的去除未使用强酸或强碱性试剂；方法耐用性好。一维使用C18反相色谱柱，流动相添加磷酸二氢钠（含四丁基硫酸氢铵，pH 3.0）；二维使用ReDual AX-C18色谱柱，在线去除四丁基硫酸氢铵和磷酸二氢钠，实现目标化合物的质谱鉴定。 卡络磺钠杂质2的质谱鉴定结果 总结岛津中国创新中心搭载的特色中心切割二维色谱杂质鉴定系统，二维使用岛津公司最新推出的ReDual™ AX-C18强阴离子交换反相混合键合相色谱柱，成功实现一维流动相中离子对试剂和无机盐的在线去除，并对卡络磺钠参比制剂中未知杂质进行了质谱鉴定。

在介绍反相离子对试剂之前，我们先回忆一下离子对色谱法（Ion-pair chromatography，IPC），离子对色谱法可被看作是以分离离子样品为目的的反相色谱法（Reversed-phase chromatography，RPC）的改良形式。IPC与RPC唯yi不同的条件是IPC在流动相中添加了离子对试剂，这些试剂能在平衡过程与酸性化合物的A-或者碱性化合物的BH+发生相互作用。“ 关于离子对试剂 ”离子对试剂是由强亲水离子形成，反作用于样品分子的中性离子对。因此，可用于同时分离带电分子和非带电分子。反相离子对色谱法是把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析的组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子生成不带电荷的中性离子，从而增加溶质与非极性固定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果。”一般情况下，在建立HPLC分离方法的时候，我们推荐由RPC开始，接着添加离子对试剂（仅当有需要时）。举个例子，当我们已知某个峰是对应一个酸性物质、碱性物质或中性物质时，我们便能准确地预测出添加的IPC试剂对溶质保留的影响。因此，当改变RPC的其他条件仍不能达到合适的分离度时，我们可以通过使用IPC试剂不断改变酸性溶质和碱性溶质的保留行为从而改善他们的分离效果。那么，IPC在什么时候或者应用于什么物质的分离会是比较合适的分离方法呢？在样品出现以下特点时我们就可以考虑使用离子对试剂：（1）在反相色谱柱上不保留或保留弱；（2）化合物带有强离子官能团，如羧基、铵基、氨基等；（3）化合物在反相体系流动相中有足够的溶解度。使用离子色谱法可令样品的保留行为产生类似于改变流动相的pH的变化，但是离子对色谱法能更好的控制酸性溶质或碱性溶质的保留行为，而且无须使用极端的流动相pH（如，pH＜2.5或pH＞8.0）。“常见的离子对试剂”常见的离子对试剂主要包括如下几类：阴离子对试剂：四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵等碱性试剂，适用于结构式中含磺酸基、羧基等的极性化合物。阳离子对试剂：甲烷磺酸钠、戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、癸烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠等，适用于结构式中含铵基、氨基等的极性化合物。其他离子对试剂：高氯酸钠、三氟乙酸、七氟丁酸等。

小伙伴们在做日常检测，会发现有些项目，测试标准上使用的流动相中加入了像庚烷磺酸钠、四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵等试剂，这类试剂我们称为离子对试剂，它可以用来改善分离和峰形、缩窄样品的保留范围等。离子对试剂可以看成是在高效液相色谱法中引入了离子色谱方法的一种表现。今天小编和小伙伴们聊聊离子对色谱法的保留基本原理和一些特殊问题。离子对色谱法（IPC）可被看做是以分离离子样品为目标的反相色谱法的改良形式。IPC和RPC唯yi不同的条件是IPC在流动相中添加了离子对试剂R+或R-，这些试剂能在平衡过程中，与酸性化合物的A-或碱性化合物的BH+发生相互作用： 离子化溶质 离子对（酸）A-+R+ ⇔ A-R+（碱）BH++R- ⇔ BH+R- 亲水性溶质 疏水性离子对（在RPC保留较少） （在RPC保留较多）使用IPC可令样品的保留行为产生类似于改变流动相pH的变化，但是IPC能更好地控制酸性溶质或碱性溶质的保留行为，而且无需使用极端的pH（如pH2.5或pH8）。典型的离子对试剂包括烷基磺酸盐R-SO3-(R-)和四烷基铵盐R4N+(R+)，以及强羧酸（通常是离子化的）（四氟乙酸、TFA；七氟丁酸酐、HFBA（R-）），还有所谓的离液剂（BF4-、ClO4-、PF6-）。有关IPC的保留机理目前有两种说法。一种说法是离子对在溶液中形成，然后被保留在色谱柱上，溶质保留平衡过程如下（以离子化的酸性溶质A-和四烷基铵盐R+形成离子对为例）：A-R+（流动相） ⇔ A-R+（固定相）根据这个说法，溶质保留由以下因素决定：① 溶质分子A在流动相中已电离的部分（取决于流动相pH和溶质的pKa）；② IPC试剂的浓度和它形成离子对的趋势；③ 离子对复合物A-R+的k值。另一种说法则认为，IPC试剂先被固定相保留，然后溶质的保留是离子交换的过程，例如，离子化的酸性流动相A-和IPC试剂R+X-：A-（流动相）+ R+X-（固定相） ⇕ A-R+（固定相）+ X-（流动相） 即是，离子对试剂 R+X-先吸附到固定相上，然后样品离子A-代替固定相上的反离子X-。这两种IPC的保留过程都可能在任一个给定的分离中占优势，但是哪一种机制起着更为重要的作用既不容易确定，对实际操作也不重要。在IPC中，可以用于控制选择性的分离条件包括：➩ pH；➩ IPC试剂的类型（磺酸盐、季铵盐、离液剂）；➩ IPC试剂的浓度；➩ 溶剂强度（B%）；➩ 溶剂类型（甲醇、乙腈等）；➩ 温度；➩ 色谱柱类型；➩ 缓冲溶液的类型和浓度。无机试剂（或“离液剂”）如ClO4-、BF4-和PF6-可用于代替常用的烷基磺酸盐作为IPC试剂。无机试剂在固定相上的保留较少，它的保留机理更接近上述的di一种说法，在流动相中形成离子对。离液剂能更好地用于梯度洗脱（有较小的基线噪音和漂移），且当B%较高时也能较好的溶解在流动相中。但是使用离子对试剂也有一些特殊问题，在某些情况下需要严格控制流动相pH；温度控制的重现性必须较高（比RPC更需要），此外，IPC中的某些问题不会在RPC分离中出现或与其他RPC有所不同。还有就是出现伪峰、改变流动相周柱平衡缓慢、有不明原因造成的糟糕的色谱峰型等。首先是伪峰。当把样品溶剂（不含样品）注入到IPC中（即空白实验），我们有时会观察到正峰和负峰同时出现的情况。导致伪峰的原因通常是由流动相和样品溶剂的组成之间存在差异引起的。而使用不纯的IPC试剂、缓冲液或其他的流动相添加剂都会使伪峰的问题更为严重。其次是缓慢的柱平衡。当使用新的流动相时，必须用足够体积的流动相冲洗色谱柱以使色谱柱达到平衡。在IPC中，IPC试剂在色谱柱上的吸附和解吸附在某些情况下非常缓慢，这会造成色谱柱不能被新的流动相完全平衡。所以，无论是旧的流动相还是新的流动相含有IPC试剂时，我们必须确定改变流动相后样品的保留具有重现性（需要以新的流动相进行几小时的冲洗色谱柱才能达到完全平衡）。更换IPC试剂时，先用特殊的洗脱剂把先前吸附在色谱柱上的IPC试剂洗脱下来，再用新的流动相对色谱柱进行平衡。阴离子试剂（如烷基磺酸盐）能用组成为50%~80%甲醇-水的洗脱剂洗脱下来；季铵盐需要使用50%甲醇-缓冲液（如，pH为4~5的100mmol/L的磷酸氢二钾溶液，加入磷酸氢二钾是为了减少季铵基团与固定相上离子化的硅醇基间的相互作用）。任一情况下，首先应使用至少等于20倍柱体积的洗脱剂来冲洗色谱柱，然后再使用新的流动相进行柱平衡。另外，像较弱的离子对缓冲液三氟乙酸（TFA）以及离液剂，不会减缓柱平衡的过程，通常用10~20倍的含TFA或离液剂的流动相冲洗色谱柱足以达到柱平衡。用含IPC试剂的流动相进行色谱柱的初始平衡，则平衡过程可能会非常缓慢。为了避免在开展常规实验的每个新系列之前都要进行12h的平衡，我们建议在完成每个系列的实验后把色谱柱浸泡在流动相（含IPC试剂）里储存。这个权宜的方法使得以IPC做含量测定时能更快的达到柱平衡；假如需要每天或每两天重复一次，我们也建议使用这个办法，然而，当以这种方式储存时，其使用寿命可能会缩短。由于IPC试剂与色谱柱的缓慢的平衡过程，即使用较剧烈的洗脱程序，也不可能把IPC试剂完全从色谱柱上洗脱下来。基于这个原因，我们建议已用IPC分离的色谱柱不要再用于开展不含IPC试剂的RPC分离（TFA和离液剂例外）。假如在IPC中观察到糟糕的峰型和（或）柱塔板数的N值较低时，可以考虑改变柱温。以上就是离子对色谱法的保留原理，和一些特殊问题的解决方法，希望对小伙伴们以后用离子对色谱法能有所帮助。