基因种突变丰度标准物

当前，新冠病毒疫情仍然在全球范围内肆虐，截止到11月30日，全球感染人数超2.6亿，死亡人数超500万。我国疫情虽然得到了较好的控制，但当前防控工作内防反弹，外防输入，形势依然非常严峻。此外，新冠病毒不断变异，导致其传染性更强。主要的突变株包括:B.1.617.2（Delta）、B.1.1.7（Alpha）、B.1.351（Beta）、P.1（Gamma）、B.1.1.529（Omicron）等。虽然目前的研究表明这些突变尚未对疫苗的有效性产生显著的影响，但针对突变株的监测和防控工作绝不能放松。近日中国计量科学研究院联合北京科兴中维生物技术有限公司，在继今年8月开发的B.1.617.2（Delta）突变株基础上，又针对新冠病毒P.1（Gamma）和B.1.351（Beta）突变株开发了全基因组RNA标准物质。该标准物质以新冠病毒P.1和B.1.351突变株为候选物，对其灭活后进行基因组RNA纯化、序列表征和量值确定。该标准物质可以作为测量标准用于新冠病毒P.1和B.1.351突变株检测方法的方法开发、方法确认和质量控制。该标准物质涵盖新冠病毒P.1和B.1.351突变株的全部序列，高通量测序结果表明不存在其他病毒序列。采用经过国际比对验证的数字PCR方法，对开放阅读框（ORF1ab）基因、核衣壳蛋白N基因、包膜蛋白E基因和刺突蛋白S基因进行了准确定值。特性量值为每管溶液中含有的新冠病毒P.1或B.1.351突变株的ORF1ab、N、E和S基因的拷贝数浓度。具体量值见表1。新冠病毒P.1突变株基因组RNA标准物质的基因组序列中S基因具体的变异位点包括：L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、T1027I、V1176F，具体见图1。图1. 新冠病毒P.1突变株S基因突变位点新冠病毒B.1.351突变株基因组RNA标准物质的基因组序列中S基因具体的变异位点包括：L18F、D80A、D215G、K417N、E484K、N501Y、D614G、H655Y、A701V、F1121V，以及L241、L242和A243缺失，具体见图2。图2. 新冠病毒B.1.351突变株S基因突变位点

当前，新冠病毒疫情仍然在全球范围内肆虐，截止到8月20日，全球感染人数超2.09亿，死亡人数达440万【1】。我国疫情虽然得到了较好的控制，但当前防控工作内防反弹，外防输入，形势依然非常严峻。尤其是去年12月报道发现了英国B.1.1.7突变毒株，S蛋白与人ACE2受体结合亲和力提高了1000倍，传播速度比之前的毒株高达70%，很快就成为了英国的主要毒株 【2】。而首次报道在印度发现的突变株B.1.617.2比英国突变株的突变位点更多，传染性更强【3】。美国、以色列等多个国家和地区在不同程度上出现疫情反弹。美国疾控中心数据显示，2021年6月中旬平均每日新增新冠肺炎病例数已下降至约1.1万例【4】；8月1日统计数据显示，过去7天内新增病例超50万例，日均新增7.2万余例，7天内新增死亡超2100例【5】。2021年4月，我国也出现输入型印度变异毒株B.1.617.2亚型。虽然目前的研究表明该突变株尚未对疫苗的有效性产生显著的影响【6】，但针对该突变株的监测和防控工作绝不能放松。自疫情爆发以来，我国成功抗疫的关键是“早发现、早隔离、早诊治”，早发现的关键是需要有灵敏的检测试剂，目前针对该突变株的检测，最急需的就是开发灵敏、快速的检测试剂盒。虽然基于前期的经验和积累，国内很多企业可以快速开发出针对突变株的检测试剂，但试剂性能评价和方法验证需要具有准确量值的标准物质作为支撑，而目前针对德尔塔突变株（B.1.617.2）的标准物质研究国内外还没有报道。目前我国已有企业针对突变株B.1.617.2开发检测试剂盒【7】，仍有大量的企业正在进行开发，急需具有针对突变株的标准物质，可以为其提供方法验证和量值溯源。此外，对于新开发的试剂要进行临床应用、申请欧盟的CE认证或美国FDA的紧急授权使用，都需要有可靠的标准物质对其性能进行评估。为此，非常有必要研制相应突变序列的标准物质，为国内IVD企业提供量值溯源，为我国新冠疫情防控提供计量技术支撑。近日中国计量科学研究院联合北京科兴中维生物技术有限公司，针对新冠病毒德尔塔突变株开发了基因组RNA标准物质。该标准物质以新冠病毒德尔塔突变株为候选物，对其基因组RNA进行纯化、序列表征和量值确定。该标准物质包含了新冠病毒德尔塔突变株的特征突变，可以作为测量标准用于新冠病毒德尔塔突变株检测方法的方法验证、质量控制和量值溯源。1.新冠病毒德尔塔突变株基因组RNA标准物质序列和量值该标准物质涵盖新冠病毒德尔塔突变株的全部序列，二代测序结果表明不存在其他病毒序列。采用经过国际比对验证的数字PCR方法，对开放阅读框（ORF1ab）基因、核衣壳蛋白N基因、包膜蛋白E基因和刺突蛋白S基因进行了准确定值。特性量值为每管溶液中含有的新冠病毒德尔塔突变株的ORF1ab、N、E和S基因的拷贝数浓度。具体量值见表1。表1. 新冠病毒德尔塔突变株基因组RNA标准物质特性量值编号名称基因标准值（×103 copies/μL）扩展不确定度（k=2）(×103 copies/μL)NIM-RM5217新型冠状病毒德尔塔（B.1.617.2）突变株基因组RNA标准物质Orf1ab基因2.000.29E基因2.140.33N基因2.370.37S基因2.450.38该标准物质的基因组序列中S基因具体的变异位点包括了T19R、G142D、R158G、L452R、T478K、D614G、D950N，以及在DEL156 -157和DEL679-685位置的缺失突变等，如图1。图1. 新冠病毒德尔塔突变株标准物质突变位点示意图2.新冠病毒德尔塔突变株基因组RNA标准物质使用方法2.1作为外标该标准物质可以作为测量标准用于病毒核酸的量值溯源。具体使用方法：对该标准物质进行5倍梯度稀释，稀释4-5个梯度后，与待测样本同时进行荧光定量PCR扩增，记录5个梯度对应的荧光定量PCR扩增的ct值。以标准物质梯度稀释后的量值的对数为横坐标，以荧光PCR扩增得到的ct值为纵坐标，进行线性拟合后可以得到标准曲线和线性方程，根据该标准曲线和待测样本扩增的ct值，实现对待测样本的病毒核酸拷贝数进行定量。使用时需要注意：1）标准物质梯度稀释所使用的稀释液应该是具体保护RNA功能的保存液或无RNA酶的水，同时为了保证量值的准确可靠，应尽可能在保护液中添加一定浓度的RNA carrier，2）由于不同的PCR扩增板所获得的ct值通常不具备可比性，因此待测样本应与标准物质同时扩增，这样得到的ct值进行比较会更准确。2.2方法开发该标准物质可以用于新冠病毒德尔塔突变株检测新方法的方法开发和建立。该标准物质的序列包括了德尔塔突变株的所有特征突变序列，可以作为测量对象用于特异检测德尔塔突变株的新方法的开发。适用于荧光定量PCR方法、数字PCR方法、环介导等温扩增（LAMP）、基因测序等方法的方法开发。2.3 方法验证该标准物质可以作为测量标准用于德尔塔突变株检测方法的方法验证。由于该标准物质的具有明确的量值及不确定度，即新冠病毒四个特征基因（ORF1ab、N、E和S）的拷贝数浓度，所以可以用于对新冠病毒德尔塔突变株检测方法的准确性、检出限和定量限等性能的验证。适用于荧光定量PCR方法、数字PCR方法、等温扩增（LAMP）等方法的方法验证。同时还可以用于验证针对非突变株开发的方法是否存在脱靶。2.4 质量控制可以用于实验室日常对试剂和仪器性能的质量控制。实验室在进行正式检测前可以先使用本标准物质进行测试，检查仪器和试剂的状态，从而保证样本检测结果的可靠。还可以将标准物质加入病毒采样管，与待测样本平行处理，参与提取、扩增和检测的全流程，对检测的全部环节进行质量控制和校准。通过对比测量值和标准物质量值，可以对提取效率和检测过程进行校准。3. 新冠病毒相关核酸标准物质截至目前，中国计量科学院共研制了体外转录、基因组、假病毒3个系列11种新冠病毒核酸标准物质（表2）【8】。这些标准物质可应用于方法建立、质量控制、仪器校准、试剂性能评估、验证与评价等多方面，为保障核酸检测结果准确、可比、可溯源，提供计量技术支撑。表2 新冠病毒核酸系列标准物质体外转录RNA名称编号标准值及不确定度（copies/μL）使用建议新型冠状病毒核酸标准物质（高浓度）GBW(E)091089E（6.37±1.01）×105 方法建立和验证，量值溯源，标曲绘制；无需提取ORF1ab（1.34±0.21）×106 N（7.21±1.28）×105 新型冠状病毒核酸标准物质（低浓度）GBW(E)091090E（5.78±0.64）×102 量值溯源，仪器和产品性能测试和评价；无需提取ORF1ab（1.07±0.14）×103 N（7.75±0.81）×102 新型冠状病毒刺突蛋白基因核糖核酸标准物质NIM-RM5208S(1.95±0.31)×103 方法建立和验证，标曲绘制；无需提取新型冠状病毒B.1.1.7突变株核衣壳蛋白基因核糖核酸NIM-RM5209N(2.07±0.35)×103 方法建立和验证，标曲绘制；无需提取基因组RNA新型冠状病毒核糖核酸基因组标准物质GBW(E)091098E（1.29±0.26）×102 包含全部基因序列；方法建立和验证，量值溯源，标曲绘制；无需提取ORF1ab（9.50±1.80）×101N（2.05±0.31）×102 新型冠状病毒核糖核酸基因组标准物质GBW(E)091099E（1.06±0.11）×103 包含全部基因序列；仪器和试剂性能测试和评价；无需提取ORF1ab（8.96±0.61）×102 N（1.73±0.13）×103 假病毒新型冠状病毒假病毒核糖核酸标准物质NIM-RM5203E（4.6±0.9）×102方法建立，标曲绘制；参与提取ORF1ab（6.5±1.2）×102 N（4.3±0.9）×102 新型冠状病毒核酸检测弱阳性标准物质（高浓度）NIM-RM5205ORF1ab3842±897全过程质量控制，性能评估等，适用于试剂盒检测限1000 copies/mL及以上N2541±601新型冠状病毒核酸检测弱阳性标准物质（低浓度）NIM-RM5206ORF1ab1157±276全过程质量控制，性能评估等，适用于试剂盒检测限500 copies/mL及以下N765±181新型冠状病毒全序列假病毒核糖核酸标准物质NIM-RM5207ORF1ab基因(266-2719)47±13包含新冠病毒全部基因序列，从病毒提取到扩增、检测，进行全过程质量控制，方法验证、试剂盒性能评价。ORF1ab基因(2720-8554)85±23ORF1ab基因(8555-13024)104±28ORF1ab基因(13025-18039)97±23ORF1ab基因(18040-21552)60±39S基因(21563-25384)54±15E基因(26245-26472)52±22N基因(28274-29533)38±14【1】https://covid19.who.int/【2】https://cov-lineages.org/global_report_B.1.1.7.html .【3】 Raman R, Patel KJ, Ranjan K. COVID-19: Unmasking Emerging SARS-CoV-2 Variants, Vaccines and Therapeutic Strategies. Biomolecules. 2021 Jul 6 11(7):993.【4】 https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/covid-data/covidview/index.html【5】 https://covid.cdc.gov/covid-data-tracker/#cases_casesinlast7days 【6】 Zhao X et al., Nutralisation of ZF2001-elicited antisera to SARS-CoV-2 variants, Lancet Microbe, 2021, https://doi.org/10.1016/S2666-5247(21)00217-2【7】https://baijiahao.baidu.com/s?id=1699542160613294305&wfr=spider&for=pc【8】https://www.ncrm.org.cn/

作者：青岛大学附属医院王晓囡、邢晓明2013年，好莱坞知名女星安吉丽娜朱莉在《纽约时报》发表了一篇名为《My Medical Choice》的文章，讲到自己的母亲与癌症斗争了近十年，于56岁时去世。而她遗传了母亲的BRCA1突变基因，这使她患乳腺癌的几率高达87%，患卵巢癌的几率也达到50%。为了尽可能地降低患癌风险，她决定接受预防性双乳切除术。两年后她又选择预防性的切除了卵巢和输卵管。BRCA1突变真的这么可怕吗？我们一起走进BRCA以及他的家族HRR来一探究竟。01 BRCA基因是什么？BRCA是breast cancer这两个英文单词前两个字母的缩写，研究者于上世纪90年代先后发现了与遗传性乳腺癌有关的基因，分别命名为乳腺癌1号基因、2号基因，英文简称BRCA1/2。实际上，BRCA1/2是两种抑癌基因，通俗的讲也就是对人体有好处的基因，它们翻译出来的蛋白质就像故障工程师一样，兢兢业业的修补受损伤或者有缺陷的基因。哪里有基因的双链断裂，哪里就有他们忙碌的身影。其实人体内不是只有BRCA1/2具有基因修复功能，而是有一个负责基因修复的大家族，被称为HRR（同源重组修复）通路，它包含的基因有：BRCA1,BRCA2，ATM,ATR,BARD1,BLM,BRIP1,CDK12,CHEK1,CHEK2,FANCA,FANCC,FANCD2,FANCE,FANCF,FANCI,FANCL,FANCM,MRE11,NBN,PALB2,RAD50,RAD51,RAD51B,RAD51C,RAD51D,RAD52,RAD54L,RPA1等。BRCA1/2是其中比较关键的两个基因，是HRR通路中的中流砥柱。02 如何检测BRCA1/2基因有没有突变？穿刺或者手术切取的组织都会被送往病理科，由病理科的医生对其进行处理并最终制作成蜡块（由石蜡包裹着的组织块）。进行BRCA1/2检测，首先需要从蜡块中提取DNA或者直接从血液中提取DNA，然后通过生物学技术对DNA中的BRCA1/2基因进行测序。由于BRCA1/2基因没有热点突变，即它的突变不集中于某几个区域上，而是在所有区域都有可能发生，所以需要利用下一代测序技术（Next generation sequencing，NGS）对BRCA1/2基因进行全外显子测序。最后根据测序数据分析可能的BRCA1/2基因突变，判定是否携带BRCA1/2基因的突变。03 有BRCA1/2突变一定得肿瘤吗？当然不是啦。其实BRCA1/2的突变分为5类，只有被归为第五类和第四类的突变才可能导致肿瘤的发生。第五类的突变被称为致病性突变，有99%的可能导致肿瘤的发生，第四类的突变被称为可能致病性的突变，有95%-99%的可能导致肿瘤的发生。那为什么发生这两类突变的BRCA1/2基因就从原来的好基因变成坏基因了呢？这是因为发生了这些突变的BRCA1/2基因在翻译时遇到了麻烦，不能翻译出具有正常功能的BRCA1/2蛋白，导致其丧失修复基因双链断裂的能力，这会影响基因组的稳定性，并引起多种肿瘤的发生。有研究指出，BRCA1/2胚系突变可使女性患卵巢癌的风险提高10-30倍，也增加了人们患乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤等多种癌症的风险。04 BRCA1/2突变会遗传吗？BRCA1/2突变分为体细胞突变和胚系突变两种类型。体细胞突变是指只有肿瘤细胞发生了突变，而人体其他部位的正常细胞则没有发生突变。这种突变不会遗传给后代。那胚系突变是什么呢？我们都知道每个人都是爸爸妈妈爱的结晶，精子和卵子结合形成受精卵，再经过妈妈十月怀胎的辛苦最终有了我们每一个个体。精子和卵子里有来自爸爸和妈妈的染色体，这两部分染色体汇集到一起就变成了我们自己的染色体。如果爸爸或者妈妈贡献给我们的染色体里含有BRCA1/2的突变，那么我们就遗传了这个突变。我们体内的每一个细胞（每个细胞都是从最初的受精卵分裂来的，都跟受精卵有相同的染色体）里都带有这个突变，我们的后代也有可能带有这个突变，这就是胚系突变。胚系突变是可以遗传的。05 怎么区分BRCA1/2的突变到底是体细胞突变还是胚系突变呢？抽取静脉血3ML，分离其中的白细胞，提取DNA进行检测，如果检测出BRCA1/2的突变，这个突变就是胚系突变。如果血液里没有检测到突变，却在肿瘤组织中检测到了，那这种突变就是体细胞突变。06 有BRCA1/2的致病性或者可能致病性突变应该怎么办？对于携带BRCA1/2胚系突变的正常人来说，可以找专业的医生进行遗传咨询，并加强高风险疾病（女性如乳腺癌、卵巢癌等；男性如前列腺癌、胰腺癌等）的筛查，做到早发现早治疗。或者根据医生的建议并结合自身状况，选择是否像安吉丽娜朱莉一样进行预防性切除术以降低患癌风险。同时建议对有风险的亲属如父母、兄弟姐妹、子女等进行遗传咨询并考虑是否进行基因检测。对携带BRCA1/2胚系突变的肿瘤患者来说，一方面可以做遗传咨询，另一方面可以选择相应的药物进行治疗。而对于BRCA1/2体细胞突变的患者来说，可直接进行药物治疗而不用做遗传咨询。07 PARP抑制剂为什么可以用来治疗具有BRCA1/2的致病性或者可能致病性突变的肿瘤患者？前面我们提到BRCA是修复DNA双链损伤的酶，而PARP则是一种修复DNA单链损伤的酶，它的全称聚腺苷二磷酸核糖聚合酶。PARP抑制剂可以选择性的抑制PARP介导的DNA单链损伤修复途径，使发生损伤的DNA单链进一步转化成DNA双链断裂。这个时候就需要BRCA闪亮登场，而如果BRCA基因发生致病性或者可能致病性的突变，如同前文所述，DNA双链断裂就得不到修复，DNA损伤不断积累，最终就导致了细胞的死亡，这被称为合成致死效应。所以在选择此类药物进行治疗前，一定要先进行基因检测，BRCA基因确实存在致病性或者可以致病性突变才可用药，用药才有效果。此外，上文我们提到BRCA1/2是HRR通路中的核心成员，其实HRR通路中的其他基因如果出现问题，如发生致病性或者可能致病性的突变，同样可以影响基因的稳定性，导致肿瘤的发生。2020年PARP抑制剂奥拉帕利获得美国FDA（美国食品药品监督管理局）批准一项新的适应症，即用于治疗HRR通路基因突变的前列腺癌患者。 了解了BRCA1/2的前世今生，揭开了它的面纱，是不是觉得它也没有那么可怕了呢？可能不是每个人都能像安吉丽娜朱莉那样喊出自己的医学宣言，但是知己知彼，百战不殆，了解它，走进它，干掉它，愿每一位患者都能战胜病魔拥抱健康。