基因种突变丰度标准物

基因定点突变，顾名思义，就是把目的基因上的一个碱基有目的的替换为另一个碱基。体外定点突变时目前分子生物学领域中一种快速有效地手段。产生定点突变操作及所需仪器简单，随着技术的发展，方法也越来越快捷简便。定点突变除了可以生成点突变，多点突变外，还可以人为产生碱基删除和添加等。体外基因定点突变是实验室中优化改造基因，研究基因功能的常用方法之一。通过改造基因序列，可以对相应氨基酸序列进行改变，进而影响蛋白质的结构和功能，探讨突变氨基酸位点在蛋白结构和功能中所起的作用。在我多年的实验中，体外基因定点突变是其中一项重要的内容。在这里，我与大家分享一下我的实验方法和心得体会。多年来，我所采用的基因定点突变的方法主要有三种，这可能也包括了目前所有的定点突变的方法。基因定点突变使用的主要仪器就是PCR扩增仪(biometra)，而这是每一个分子生物学实验室的必需品，也就是大家吃饭的家伙。下面从繁到简对我所采用的突变方法进行一下简单描述。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/12/201212032022_409068_1306303_3.jpg我所使用过的定点突变方法简单的说就是三步，两步和一步PCR法。三步PCR法是我早期在实验室使用的定点突变方法。利用三步PCR法构建一个点突变，需要4条PCR引物：L1，L2，R1和R2。L1和R1是目的基因5‘和3‘端的引物，分别包含起始和终止密码子。突变点设计在引物L2和R2的正中间位置，L2和R2是完全互补的两条PCR引物，长度一般在28-40 bp之间，推荐长度31-35 bp，这样可以保证突变的两边有效搭在一起。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/12/201212032026_409072_1306303_3.jpg三轮PCR均采用常规PCR反应条件，第一轮分别以L1和R2，L2和R1扩增获得目的片段L和R。第二轮PCR，不需要引物，仅加入模板L和R各100 nmol，进行约20 轮的PCR反应，获得产物m1。第三轮PCR以m1为模板，L1和R1为引物进行PCR扩增。最终得到目的产物m。得到的PCR产物进行克隆转化得到进一步扩增，便获得了突变的目的基因。在随后的实验中，我将三步PCR法简化为两步法PCR。两步法PCR和三步法PCR一样，需要引物四条，引物设计也与三步法相同，只是在第一轮PCR获得产物L和R之后不再单独进行第二轮PCR，而直接在PCR体系中加入等mol的产物L和R

[align=center][b][font=黑体][font=黑体]基于[/font][font=黑体]TILLING技术的基因突变分析[/font][/font][/b][/align][align=center][/align][font=黑体]小麦是我国主要的粮食作物，其栽培面积和总产量仅次于水稻，随着生活水平的日益提高，人们对小麦品质的要求也越来越高，因此，品质改良已成为小麦育种工作的重要目标之一[/font][sup][font='Times New Roman'][[/font][/sup][sup][font=黑体][font=Times New Roman]1[/font][/font][/sup][sup][font='Times New Roman']][/font][/sup][font=黑体]。[/font][font=黑体][font=黑体]小麦是异源[/font][font=Times New Roman]6[/font][font=黑体]倍体植物，基因组庞大，突变机制较为复杂[/font][/font][font=黑体][font=黑体]，反向遗传学技术，例如[/font][font=Times New Roman]T-DNA[/font][font=黑体]插入、转座子标签，已经越来越多的应用于研究中。然而，这些方法大多数，应用于基因组较小的模式植物，小麦的多倍性及转化体获得的难度，制约了这些方法的更好使用，而[/font][font=Times New Roman]TILLING[/font][font=黑体]技术不受物种倍性影响，[/font][/font][font=黑体]推动了基因功能研究和品质改良的发展[/font][font=黑体]。[/font][b][font=黑体][font=宋体]1 [/font][font=黑体]材料与方法[/font][/font][/b][font=黑体][font=Times New Roman]1.1 [/font][/font][font=黑体]植物[/font][font=黑体]材料[/font][font=黑体]春小麦（[/font][i][font=黑体][font=Times New Roman]Triticum aestivum[/font][/font][/i][font=黑体] [font=Times New Roman]L.[/font][font=黑体]）品种龙辐麦[/font][/font][font='Times New Roman']17[font=黑体]经航天诱变[/font][/font][font=黑体]选育而成。[/font][font=黑体][font=黑体]共获得[/font][font=Times New Roman]1122[/font][font=黑体]个[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]EMS[/font][font=黑体]诱变的龙辐麦[/font][/font][font='Times New Roman']17[/font][font=黑体] [font=Times New Roman]M[/font][/font][sub][font=黑体][font=Times New Roman]2[/font][/font][/sub][font=黑体]代单粒传[/font][font=黑体]植株，苗期单株编号，采集[/font][font=黑体][font=黑体]叶片，迅速冷冻干燥，用于[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=黑体]提取。[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]1.2 [/font][font=黑体]基因组[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=黑体]提取及[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=黑体]池构建[/font][/font][font=黑体][font=黑体]将干燥后的叶片按编号置于装有珠子的[/font][font=Times New Roman]1.5ml[/font][font=黑体]离心管中，利用组织研磨器[/font][font=Times New Roman]Vibration Mill Type MM301[/font][font=黑体]（[/font][font=Times New Roman]Retsch GmbH Co, Germany[/font][font=黑体]）将叶片磨成粉末状；加[/font][font=Times New Roman]600[/font][/font][font='Times New Roman']μl[/font][font=黑体] [font=Times New Roman]DNA[/font][/font][font='Times New Roman'] Extraction buffer[/font][font='Times New Roman'] [/font][font='Times New Roman'][[/font][font=黑体][font=Times New Roman]0.1[/font][/font][font='Times New Roman'] mol/ L[/font][font=黑体] [/font][font=黑体][font=Times New Roman]Tris[/font][font=黑体]；[/font][font=Times New Roman]0.[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]1[/font][/font][font='Times New Roman'] mol/ L[/font][font=黑体] [font=Times New Roman]KCl[/font][font=黑体]；[/font][font=Times New Roman]0.5M EDTA pH 8.0[/font][font=黑体]；[/font][font=Times New Roman]1[/font][/font][font='Times New Roman'] mol/ L[/font][font=黑体] [font=Times New Roman]PVP 40[/font][font=黑体]；[/font][font=Times New Roman]1.5[/font][/font][font='Times New Roman'] mol/ L[/font][font='Times New Roman'] Na[/font][sub][font='Times New Roman']2[/font][/sub][font='Times New Roman']S[/font][sub][font='Times New Roman']2[/font][/sub][font='Times New Roman']O[/font][sub][font='Times New Roman']6[/font][/sub][font='Times New Roman']][/font][font=黑体][font=黑体]，充分混匀；保温振动[/font][font=Times New Roman]1 h[/font][font=黑体]；加[/font][font=Times New Roman]200μl 5 mol/[/font][/font][font='Times New Roman']L KAc[/font][font=黑体][font=黑体]，混匀并离心；取约[/font][font=Times New Roman]300 μl[/font][font=黑体]上清液加至[/font][font=Times New Roman]165 μl[/font][font=黑体]预冷的异丙醇中，沉淀[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=黑体]；用[/font][font=Times New Roman]70 %[/font][font=黑体]乙醇洗[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=黑体]，干燥后，溶于[/font][font=Times New Roman]TER[/font][/font][font='Times New Roman'][[/font][font=黑体][font=Times New Roman]Tris 10mmol/L[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]EDTA 1 mmol/L[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]RNA[/font][font=黑体]酶[/font][font=Times New Roman]0.05mg/ml[/font][/font][font='Times New Roman']][/font][font=黑体][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]-20 [/font][font=黑体]℃保存备用。[/font][/font][font=黑体][font=黑体]利用[/font][font=Times New Roman]1.0%[/font][font=黑体]的琼脂糖凝胶电泳检测[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=黑体]样品，并将其稀释至[/font][font=Times New Roman]40 ng/[/font][/font][font='Times New Roman']μ[/font][font=黑体][font=Times New Roman]l[/font][font=黑体]，随机两两等量混匀，构建两倍的[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=黑体]池，用于后续[/font][font=Times New Roman]TILLING[/font][font=黑体]筛选。[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]1.3 [/font][font=黑体]特异性引物设计及筛选[/font][/font][font=黑体][font=黑体]根据[/font][font=Times New Roman]NCBI[/font][font=黑体]提供的目标基因序列信息，在线设计引物，并用[/font][font=Times New Roman]1%[/font][font=黑体]琼脂糖凝胶电泳检测[/font][font=Times New Roman][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=黑体]产物，选择[/font][font=Times New Roman][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=黑体]产物条带单一，大小在[/font][font=Times New Roman]700-1500[/font][font=黑体]左右的[/font][font=Times New Roman]4[/font][font=黑体]对引物（表[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=黑体]），其中[/font][/font][font=黑体]除[/font][i][font=黑体][font=Times New Roman]Pinb[/font][/font][/i][font=黑体][font=黑体]引自[/font][font=Times New Roman]Wang[/font][font=黑体]等[/font][/font][sup][font='Times New Roman'][[/font][/sup][sup][font=黑体][font=Times New Roman]2[/font][/font][/sup][sup][font='Times New Roman']][/font][/sup][font=黑体][font=Times New Roman](2008)[/font][font=黑体]。[/font][/font][align=center][font=黑体][font=黑体]表[/font][font=Times New Roman]1 [/font][font=黑体]用于[/font][font=Times New Roman]TILLING[/font][font=黑体]检测的基因及其荧光标记引物序列[/font][/font][/align][align=center][font='Times New Roman']Table1 [/font][font=黑体] [font=Times New Roman]Genes and their [/font][/font][font='Times New Roman']IRDye labled primer sequence[/font][font=黑体][font=Times New Roman]s [/font][/font][font='Times New Roman']used[/font][font=黑体] [font=Times New Roman]in TILLING[/font][/font][font='Times New Roman'] [/font][/align][table][tr][td=1,2][align=center][b][font=黑体]基因[/font][/b][/align][align=center][b][font=黑体][font=Times New Roman]Gene[/font][/font][/b][/align][/td][td=2,1][align=center][b][font=黑体][font=黑体]引物序列[/font] [font=Times New Roman]Primer sequence (5[/font][font=黑体]′–[/font][font=Times New Roman]3[/font][font=黑体]′[/font][font=Times New Roman])[/font][/font][/b][/align][/td][td=1,2][align=center][b][font=黑体]长度[/font][/b][/align][align=center][b][font='Times New Roman']Length[/font][font=黑体][font='Times New Roman'] [/font][font=Times New Roman](bp)[/font][/font][/b][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][b][font=黑体][font=黑体]正向[/font] [font=Times New Roman]Forward[/font][/font][/b][/align][/td][td][align=center][b][font=黑体][font=黑体]反向[/font] [font=Times New Roman]Reverse [/font][/font][/b][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][i][font='Times New Roman']P[/font][font=黑体][font=Times New Roman]in[/font][/font][font='Times New Roman']b[/font][/i][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman']CCAACGAAACTAATGAGAAATAAAAAGGTG[/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman']AAGTTGTTGGATGGACGAATAAGGTT[/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman']1334[/font][font=黑体][font='Times New Roman'] [/font][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][i][font='Times New Roman']W[/font][font=黑体][font=Times New Roman]a[/font][/font][font='Times New Roman']x[/font][font=黑体][font=Times New Roman]y[/font][/font][/i][/align][/td][td][align=center][font=黑体][font=Times New Roman]ACCCGCATGGTGTTTGATAATTTCAGTG[/font][/font][/align][/td][td][align=center][font=黑体][font=Times New Roman]AGAATGCCACCTAGCCATGAAATGAGT[/font][/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman']790[/font][font=黑体][font='Times New Roman'] [/font][/font][/align][/td][/tr][/table][font=黑体][font=Times New Roman]1.4 TILLING[/font][font=黑体]检测[/font][/font][font=黑体]参照潘娜[/font][sup][font='Times New Roman'][[/font][/sup][sup][font=黑体][font=Times New Roman]3[/font][/font][/sup][sup][font='Times New Roman']][/font][/sup][font=黑体][font=黑体]（[/font][font=Times New Roman]2011[/font][font=黑体]）建立的小麦[/font][font=Times New Roman]TILLING[/font][font=黑体]技术检测平台，对目的基因进行检测。采用[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]Touchdown [/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=黑体]程序，[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]10μl [/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][/font][font=黑体]体系含[/font][font='Times New Roman']10 ×Buffer[/font][font=黑体] [font=Times New Roman]0.5μl[/font][font=黑体]；[/font][/font][font='Times New Roman']Mg[/font][sup][font='Times New Roman']2+[/font][/sup][sup][font=黑体] [/font][/sup][font=黑体][font=Times New Roman]0.6[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]μl[/font][/font][font=黑体]；[/font][font=黑体][font=Times New Roman]dNTP [/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]0.8[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]μl[/font][/font][font=黑体]；[/font][font=黑体]引物各[/font][font=黑体][font=Times New Roman]0.4[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]μl[/font][font=黑体]；[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]Ex Taq HS DNA[/font][font=黑体]聚合酶[/font][font=Times New Roman]0.05[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]μl[/font][font=黑体]，[/font][/font][font=黑体][font=黑体]在[/font][font=Times New Roman]Bio-Rad c1000[/font][font=黑体]仪上扩增。扩增后加[/font][font=Times New Roman]20[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]μl[/font][/font][font=黑体] [font=Times New Roman]0.1M CEL[/font][font=黑体]Ⅰ酶，[/font][font=Times New Roman]45[/font][font=黑体]℃酶切[/font][font=Times New Roman]15 min[/font][font=黑体]，利用[/font][font=Times New Roman]Sephadex G50[/font][font=黑体]（[/font][font=Times New Roman]GE Healthcare [/font][font=黑体]公司）纯化板纯化酶切产物，并[/font][font=Times New Roman]90[/font][font=黑体]℃浓缩[/font][font=Times New Roman]35-45 min[/font][font=黑体]。利用[/font][font=Times New Roman]6[/font][font=黑体]％变性聚丙烯酰胺凝胶，在[/font][font=Times New Roman]LI-COR 4300[/font][font=黑体]仪器中电泳检测酶切产物[/font][/font][font=黑体]并[/font][font=黑体][font=黑体]采用[/font][font=Times New Roman]Gelbuddy[/font][font=黑体]软件对电泳图像分析处理，标记突变位点。[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]1.5 [/font][font=黑体]基因点突变分析[/font][/font][font=黑体][font=黑体]检测到突变后对[/font][font=Times New Roman][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=黑体]产物进行测序验证，利用[/font][font=Times New Roman]Invitrogen[/font][font=黑体]软件、[/font][font=Times New Roman]NCBI[/font][font=黑体]等对序列进行比对、翻译等分析，确定突变位置与类型。[/font][/font][font=黑体][font=黑体]点突变密度[/font][font=Times New Roman](%)=[/font][font=黑体]突变碱基数[/font][font=Times New Roman]/[/font][font=黑体]检测总碱基数×[/font][font=Times New Roman]100%[/font][font=黑体]。[/font][/font][b][font=黑体][font=宋体]2 [/font][font=黑体]结果与分析[/font][/font][/b][font=黑体]本实验对[/font][font=黑体]小麦籽粒硬度基因[/font][i][font=黑体][font=Times New Roman]pinb[/font][/font][/i][font=黑体][font=黑体]进行了[/font][font=Times New Roman]1122[/font][font=黑体]个单株的[/font][font=Times New Roman]TILLING[/font][font=黑体]检测。[/font][/font][font=黑体]基因的突变密度分别为[/font][font=黑体][font=Times New Roman]1/374.18 kb[/font][/font][font=黑体]。[/font][i][font=黑体][font=Times New Roman]Pinb[/font][/font][/i][font=黑体][font=黑体]基因共获得[/font][font=Times New Roman]7[/font][font=黑体]个突变株系的[/font][font=Times New Roman]4[/font][font=黑体]个不同的突变位点[/font][font=Times New Roman]([/font][font=黑体]图[/font][font=Times New Roman]1)[/font][font=黑体]，有[/font][font=Times New Roman]6[/font][font=黑体]个突变单株的碱基突变位点均位于外显子区域，突变株编号及突变位点分别是[/font][font=Times New Roman]LF996[/font][font=黑体]第[/font][/font][font='Times New Roman']51[/font][font=黑体][font=Times New Roman]2bp[/font][font=黑体]位的[/font][font=Times New Roman]C-T[/font][font=黑体]碱基转换，[/font][font=Times New Roman]LF[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]892[/font][font=黑体]、[/font][font=Times New Roman]LF997[/font][font=黑体]、[/font][font=Times New Roman]LF919[/font][font=黑体]第[/font][/font][font='Times New Roman']7[/font][font=黑体][font=Times New Roman]26bp[/font][font=黑体]位的[/font][/font][font='Times New Roman']G[/font][font=黑体][font=Times New Roman]-[/font][/font][font='Times New Roman']A[/font][font=黑体][font=黑体]碱基转换，及[/font][font=Times New Roman]LF791[/font][font=黑体]、[/font][font=Times New Roman]LF1114[/font][font=黑体]第[/font][/font][font='Times New Roman']750[/font][font=黑体][font=Times New Roman]bp[/font][font=黑体]位的[/font][/font][font='Times New Roman']G[/font][font=黑体][font=Times New Roman]-[/font][/font][font='Times New Roman']A[/font][font=黑体][font=黑体]碱基转换，[/font][font=Times New Roman]LF996 [/font][/font][i][font=黑体][font=Times New Roman]pinb[/font][/font][/i][font=黑体][font=黑体]基因第[/font][font=Times New Roman]37[/font][font=黑体]为氨基酸[/font][font=Times New Roman]S[/font][font=黑体]变为氨基酸[/font][font=Times New Roman]F[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]LF[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]892[/font][font=黑体]、[/font][font=Times New Roman]LF997[/font][font=黑体]、[/font][font=Times New Roman]LF919[/font][/font][i][font=黑体] [font=Times New Roman]pinb[/font][/font][/i][font=黑体][font=黑体]基因第[/font][font=Times New Roman]110[/font][font=黑体]为氨基酸[/font][font=Times New Roman]G[/font][font=黑体]变为氨基酸[/font][font=Times New Roman]S[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]LF791[/font][font=黑体]、[/font][font=Times New Roman]LF1114[/font][font=黑体]第[/font][font=Times New Roman]116[/font][font=黑体]位氨基酸[/font][font=Times New Roman]W[/font][font=黑体]被终止，内含子区域突变是[/font][font=Times New Roman]LF890[/font][font=黑体]突变株第[/font][font=Times New Roman]350bp[/font][font=黑体]碱基[/font][font=Times New Roman]G[/font][font=黑体]转换为碱基[/font][font=Times New Roman]A[/font][font=黑体]。见表[/font][font=Times New Roman]1[/font][/font][align=center][img=,442,414]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/12/202212160839201707_5062_3237657_3.png!w442x414.jpg[/img][/align][align=center][font=黑体] [/font][/align][align=center][font=黑体][font=黑体]图[/font][font=Times New Roman]1 [/font][/font][i][font='Times New Roman']W[/font][font=黑体][font=Times New Roman]a[/font][/font][font='Times New Roman']x[/font][font=黑体][font=Times New Roman]y[/font][/font][/i][font=黑体]基因电泳图[/font][/align][align=center][font='Times New Roman']Fig[/font][font=黑体][font=Times New Roman]1 [/font][/font][font='Times New Roman']E[/font][font=黑体][font=Times New Roman]lectrophorogram of [/font][/font][i][font='Times New Roman']W[/font][font=黑体][font=Times New Roman]a[/font][/font][font='Times New Roman']x[/font][font=黑体][font=Times New Roman]y gene[/font][/font][/i][/align][align=center][i][font=黑体] [/font][/i][/align][font='Times New Roman'][/font][align=center][font=黑体][font=黑体]表[/font][font=Times New Roman]1[/font][/font][font=黑体] [font=黑体]基因点突变信息[/font][/font][/align][align=center][font=黑体][font=Times New Roman]Table1 Point[/font][/font][font='Times New Roman'] mutations[/font][font=黑体] [font=Times New Roman]of[/font][/font][font='Times New Roman'] quality[/font][i][font=黑体] [/font][/i][font=黑体][font=Times New Roman]gene[/font][/font][/align][table][tr][td][align=center][b][font='Times New Roman'][font=黑体]基因名称[/font][/font][/b][/align][align=center][b][font='Times New Roman']Gene[/font][font=黑体][font='Times New Roman'] [/font][/font][font='Times New Roman']name[/font][/b][/align][/td][td][align=center][b][font='Times New Roman'][font=黑体]登录号[/font][/font][/b][/align][align=center][b][font='Times New Roman']Accession[/font][font=黑体][font='Times New Roman'] [/font][/font][font='Times New Roman']No.[/font][/b][/align][/td][td][align=center][b][font='Times New Roman'][font=黑体]基因大小[/font][/font][/b][/align][align=center][b][font='Times New Roman']Gene size[/font][font=黑体][font='Times New Roman'] [/font][/font][font='Times New Roman'](bp)[/font][/b][/align][/td][td][align=center][b][font='Times New Roman'][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][font=黑体]扩增长度[/font][/font][/b][/align][align=center][b][font='Times New Roman'][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] size (bp)[/font][/b][/align][/td][td][align=center][b][font='Times New Roman'][font=黑体]等位变异[/font][/font][/b][/align][align=center][b][font='Times New Roman']Mutant[/font][font=黑体][font='Times New Roman'] [/font][/font][font='Times New Roman']allele[/font][/b][/align][/td][td][align=center][b][font='Times New Roman'][font=黑体]氨基酸突变[/font][/font][/b][/align][align=center][b][font='Times New Roman']amino acid[/font][font=黑体][font='Times New Roman'] [/font][/font][font='Times New Roman']mutation[/font][/b][/align][/td][td][align=center][b][font='Times New Roman'][font=黑体]突变[/font][/font][font=黑体]株编号[/font][/b][/align][align=center][b][font=Calibri]Number[/font][font=黑体][font='Times New Roman'] [/font][/font][font='Times New Roman']of mutation[/font][/b][/align][/td][td][align=center][b][font='Times New Roman'][font=黑体]总突变频率[/font][/font][/b][/align][align=center][b][font='Times New Roman']Total[/font][/b][font=Calibri][color=#434343] [/color][/font][b][font='Times New Roman']mutation density[/font][font=黑体][font='Times New Roman'] [/font][/font][font='Times New Roman'](kb)[/font][/b][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][i][font='Times New Roman']pinb[/font][/i][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman']AJ302100.1[/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman']870[/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman']1334[/font][/align][/td][td][align=center][font=黑体][font=Times New Roman]C[/font][/font][font='Times New Roman']51[/font][font=黑体][font=Times New Roman]2T[/font][/font][/align][/td][td][align=center][font=黑体][font=Times New Roman]S37F[/font][/font][/align][/td][td][align=center][font=黑体][font=Times New Roman]996[/font][/font][/align][/td][td=1,4][align=center][font=黑体][font=Times New Roman]1/374.18 [/font][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='Times New Roman'] [/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman'] [/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman'] [/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman'] [/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman']G7[/font][font=黑体][font=Times New Roman]26[/font][/font][font='Times New Roman']A [/font][/align][/td][td][align=center][font=黑体][font=Times New Roman]G110S [/font][/font][/align][/td][td][align=center][font=黑体][font=Times New Roman]892[/font][font=黑体]、[/font][font=Times New Roman]919[/font][font=黑体]、[/font][font=Times New Roman]997[/font][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='Times New Roman'] [/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman'] [/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman'] [/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman'] [/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman']G750A[/font][/align][/td][td][align=center][font=黑体][font=Times New Roman]W116-[/font][/font][/align][/td][td][align=center][font=黑体][font=Times New Roman]791[/font][font=黑体]、[/font][font=Times New Roman]1114[/font][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='Times New Roman'] [/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman'] [/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman'] [/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman'] [/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman']G350A[/font][/align][/td][td][align=center][font='Times New Roman'][font=黑体]未改变[/font][/font][/align][/td][td][align=center][font=黑体][font=Times New Roman]890[/font][/font][/align][/td][/tr][/table][font='Times New Roman'][/font][b][b][font=黑体][font=Times New Roman]3[/font][/font][font=黑体] [font=黑体]讨论[/font][/font][/b][/b][font=黑体]籽粒硬度是小麦重要的品质性状，对食品加工及磨粉质量都有重要影响。[/font][i][font='Times New Roman']P[/font][font=黑体][font=Times New Roman]inb[/font][/font][/i][font=黑体]是调控籽粒硬度的主效基因之一，与[/font][i][font=黑体][font=Times New Roman]pina[/font][/font][/i][font=黑体]基因共同作用决定小麦胚乳质地[/font][sup][font='Times New Roman'][[/font][/sup][sup][font=黑体][font=Times New Roman]4-5[/font][/font][/sup][sup][font='Times New Roman']][/font][/sup][font=黑体]。[/font][font=黑体]本实验[/font][i][font=黑体][font=Times New Roman]Pinb[/font][/font][/i][font=黑体]基因的突变密度是[/font][font=黑体][font=Times New Roman]1/374.18 [/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]kb[/font][font=黑体]，低于[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]Feiz[/font][font=黑体]等[/font][/font][sup][font='Times New Roman'][[/font][/sup][sup][font=黑体][font=Times New Roman]6[/font][/font][/sup][sup][font='Times New Roman']][/font][/sup][font=黑体]在普通软质小麦突变体库得到的[/font][i][font=黑体][font=Times New Roman]pinb[/font][/font][/i][font=黑体]基因[/font][font=黑体][font=Times New Roman]1/12 kb[/font][font=黑体]的[/font][/font][font=黑体]突变密度，但高于[/font][font=黑体]潘娜[/font][sup][font='Times New Roman'][[/font][/sup][sup][font=黑体][font=Times New Roman]3[/font][/font][/sup][sup][font='Times New Roman']][/font][/sup][font=黑体][font=黑体]利用空间诱变新麦[/font][font=Times New Roman]18[/font][font=黑体]突变体库群体得到的该基因[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]1/3073 kb[/font][font=黑体]的[/font][/font][font=黑体]突变密度。[/font][font=黑体][font=Times New Roman]Morris[/font][font=黑体]等[/font][/font][sup][font='Times New Roman'][[/font][/sup][sup][font=黑体][font=Times New Roman]5, 7[/font][/font][/sup][sup][font='Times New Roman']][/font][/sup][font=黑体]获得的硬红春小麦[/font][i][font=黑体][font=Times New Roman]pinb[/font][/font][/i][font=黑体]基因突变体[/font][font=黑体]，分别发生在[/font][i][font=黑体][font=Times New Roman]pinb[/font][/font][/i][font=黑体][font=黑体]基因第[/font][font=Times New Roman]39[/font][font=黑体]位和第[/font][font=Times New Roman]44[/font][font=黑体]位的色氨基酸[/font][font=Times New Roman]T[/font][font=黑体]及第[/font][font=Times New Roman]56[/font][font=黑体]位半胱氨酸[/font][font=Times New Roman]C[/font][font=黑体]，均突变为终止密码子。[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]Wang[/font][font=黑体]等[/font][/font][sup][font='Times New Roman'][[/font][/sup][sup][font=黑体][font=Times New Roman]13[/font][/font][/sup][sup][font='Times New Roman']][/font][/sup][font=黑体]获得[/font][i][font=黑体][font=Times New Roman]Pinb[/font][/font][/i][font=黑体][font=黑体]基因，[/font][font=Times New Roman]382bp[/font][font=黑体]处[/font][font=Times New Roman]C [/font][/font][font='Times New Roman']–[/font][font=黑体] [font=Times New Roman]T[/font][font=黑体]碱基转换和[/font][font=Times New Roman]257bp[/font][font=黑体]处[/font][font=Times New Roman]G [/font][/font][font='Times New Roman']–[/font][font=黑体] [font=Times New Roman]A[/font][font=黑体]碱基转换。[/font][/font][font=黑体]在潘娜[/font][sup][font='Times New Roman'][[/font][/sup][sup][font=黑体][font=Times New Roman]3[/font][/font][/sup][sup][font='Times New Roman']][/font][/sup][font=黑体]创制[/font][font=黑体][font=黑体]的[/font][font=Times New Roman]TILLING[/font][font=黑体]群体中，[/font][/font][i][font=黑体][font=Times New Roman]pinb[/font][/font][/i][font=黑体][font=黑体]基因组[/font][font=Times New Roman]736 bp[/font][font=黑体]的[/font][font=Times New Roman]A[/font][font=黑体]碱基缺失，引起移码突变，而本实验突变株[/font][font=Times New Roman]LF[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]791[/font][font=黑体]、[/font][font=Times New Roman]LF1114[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]LF996[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]LF[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]892[/font][font=黑体]、[/font][font=Times New Roman]LF997[/font][font=黑体]、[/font][font=Times New Roman]LF919[/font][font=黑体]的基因突变依次为[/font][/font][font='Times New Roman']750[/font][font=黑体][font=Times New Roman]bp[/font][font=黑体]位的[/font][/font][font='Times New Roman']G[/font][font=黑体][font=Times New Roman]-[/font][/font][font='Times New Roman']A[/font][font=黑体]碱基转换，[/font][font='Times New Roman']51[/font][font=黑体][font=Times New Roman]2bp[/font][font=黑体]位的[/font][font=Times New Roman]C-T[/font][font=黑体]碱基转换，[/font][/font][font='Times New Roman']7[/font][font=黑体][font=Times New Roman]26bp[/font][font=黑体]位的[/font][/font][font='Times New Roman']G[/font][font=黑体][font=Times New Roman]-[/font][/font][font='Times New Roman']A[/font][font=黑体]碱基转换，[/font][font=黑体]均导致错义突变。[/font][font=黑体]王亮等[/font][sup][font='Times New Roman'][[/font][/sup][sup][font=黑体][font=Times New Roman]8[/font][/font][/sup][sup][font='Times New Roman']][/font][/sup][font=黑体][font=黑体]和[/font][font=Times New Roman]Chen[/font][font=黑体]等[/font][/font][sup][font='Times New Roman'][[/font][/sup][sup][font=黑体][font=Times New Roman]9[/font][/font][/sup][sup][font='Times New Roman']][/font][/sup][font=黑体][font=黑体]的研究中几乎所有[/font][font=Times New Roman]Puroindoline[/font][font=黑体]变异类型的籽粒硬度值都显著高于野生型，而[/font][/font][font=黑体][font=黑体]本实验，对突变株进行表型分析，籽粒硬度测定显示[/font][font=Times New Roman]LF996[/font][font=黑体]、 [/font][font=Times New Roman]LF[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]892[/font][font=黑体]、[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]LF1114[/font][font=黑体]突变株的[/font][/font][font=黑体]籽粒硬度均[/font][font=黑体]极显著低于野生型。此外，[/font][font=黑体]突变体自交系研究发现[/font][font=黑体]，突变[/font][font=黑体]对小麦出粉率、面包体积、面粉灰分等品质性状均有影响，[/font][font=黑体][font=黑体]不同[/font][font=Times New Roman]Puroindoline[/font][font=黑体]变异类型之间在磨粉、面包等加工品质上也存在较差别[/font][/font][sup][font='Times New Roman'][[/font][/sup][sup][font=黑体][font=Times New Roman]9-10[/font][/font][/sup][sup][font='Times New Roman']][/font][/sup][font=黑体]。基于以上的研究发现，可利用本实验获得的突变株，进行后代品质研究，为品质改良奠定基础。[/font][b][b][font=黑体][font=Times New Roman]4 [/font][/font][font=黑体][font=黑体]结[/font] [font=黑体]论[/font][/font][/b][/b][font=黑体]本研究所获得的基因点突变及表型突变株为植物基因功能研究及小麦品质改良提供了新材料。[/font][font=黑体] [/font][font=黑体] [/font][font=黑体][font=Times New Roman]References[/font][/font][font='Times New Roman'][[/font][font=黑体][font=Times New Roman]1[/font][/font][font='Times New Roman']][/font][font=黑体] [/font][font=黑体][font=Times New Roman]Liu L([/font][font=黑体]刘丽[/font][font=Times New Roman]), Yang J-H([/font][font=黑体]杨金华[/font][font=Times New Roman]), Hu Y-X([/font][font=黑体]胡银星[/font][font=Times New Roman]), Cheng G([/font][font=黑体]程耿[/font][font=Times New Roman]).[/font][/font][font='Times New Roman'] Research Progress in Effects of Glutenin Subunits on[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']Wheat Processing Quality[/font][font=黑体][font=Times New Roman].[/font][/font][font='Times New Roman'] [/font][font=黑体] [/font][i][font='Times New Roman']Journal of Agricultural Science and Technology[/font][/i][font=黑体] [font=Times New Roman]([/font][font=黑体]中国农业科技导报[/font][font=Times New Roman]), 2012, 14(1): 33-42 [/font][/font][font='Times New Roman'](in Chinese with English abstract)[/font][font='Times New Roman'][[/font][font=黑体][font=Times New Roman]2[/font][/font][font='Times New Roman']][/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']Wang J, Sun J Z, Liu D C, Yang W L, Wang D W, Tong Y P, Zhang A M. Analysis of [/font][i][font='Times New Roman']Pina[/font][/i][font='Times New Roman'] and [/font][i][font='Times New Roman']Pinb[/font][/i][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']alleles in the microcore collections of chinese wheat germplasm by Ecotilling and identification of[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']a novel [/font][i][font='Times New Roman']Pinb[/font][/i][font='Times New Roman'] allele[/font][font=黑体][font=Times New Roman]. [/font][/font][font='Times New Roman'] [/font][i][font='Times New Roman']Journal of Cereal Science[/font][/i][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']2008, 48(3): 836-[/font][font=黑体][font=Times New Roman]842[/font][/font][font='Times New Roman'][[/font][font=黑体][font=Times New Roman]3[/font][/font][font='Times New Roman']][/font][font=黑体][font=黑体]潘娜[/font][font=Times New Roman]. [/font][font=黑体]空间环境诱发小麦突变体的[/font][font=Times New Roman]TILLING[/font][font=黑体]分析[/font][font=Times New Roman], [/font][font=黑体]中国农业科学院[/font][font=Times New Roman], 2011.[/font][/font][font='Times New Roman'][[/font][font=黑体][font=Times New Roman]4[/font][/font][font='Times New Roman']][/font][font=黑体][font=Times New Roman]CaPPaerlliR[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]Bo[/font][font=黑体]币[/font][font=Times New Roman]elloqGirouxMJ[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]AmoorsoMGPuorindolineA[/font][font=黑体]一[/font][font=Times New Roman]geneexPerssion15involved[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]inassociationofPuroindolinetostacrh.TheoerctialandAPPliedGenetics[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]2003[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]107:1463[/font][font=黑体]一[/font][font=Times New Roman]1468[/font][/font][font='Times New Roman'][[/font][font=黑体][font=Times New Roman]5[/font][/font][font='Times New Roman']][/font][font=黑体][font=Times New Roman]Chen F. Molecular Characterization of Puroindoline Alleles in Chinese and CIMMYT Common Wheats and Their [/font][/font][font='Times New Roman']Eeffct[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']on[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']Porcessing[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']Quaiity[/font][font='Times New Roman'][[/font][font=黑体][font=Times New Roman]6[/font][/font][font='Times New Roman']]Feiz L, Martin J M, Giroux M J. Creation and functional analysis of new Puroindoline alleles[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']in Triticum aestivum.[/font][i][font='Times New Roman']Theoretical and Applied Genetics[/font][/i][font='Times New Roman'],2009, 118:247-257[/font][font='Times New Roman'][[/font][font=黑体][font=Times New Roman]7[/font][/font][font='Times New Roman']][/font][font=黑体] [font=Times New Roman]Morris C F[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]Lillemo M[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]Simeone M C[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]Giorux M J[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]Bbab S L[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]Kimberiee K K.Pervalence of [/font][/font][font='Times New Roman']Puorindoline[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']garin[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']hdarness[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']genotypes[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']among[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']historieally[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']significant[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']North[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']American[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']s[/font][font=黑体][font=Times New Roman]p[/font][/font][font='Times New Roman']ring[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']and[/font][font=黑体] [/font][font='Times New Roman']winter[/font][font=黑体] [font=Times New Roman]wheats. [/font][/font][i][font=黑体][font=Times New Roman]Crop Scienee[/font][/font][/i][font=黑体][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]2001,41:218-228[/font][/font][font='Times New Roman'][[/font][font=黑体][font=Times New Roman]8[/font][/font][font='Times New Roman']][/font][font=黑体] [font=Times New Roman]C[/font][/font][font=黑体][font=Times New Roman]hen F[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]He z H[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]Xia x C[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]el a1[/font][font=黑体]．[/font][font=Times New Roman]Molecular and biochemical charac[/font][font=黑体]—[/font][/font][font='Times New Roman']terization of P“roindoline a and b alleles in Chinese landraces and[/font][font=黑体][font=Times New Roman]historical eultivars[J][/font][font=黑体]．[/font][font=Times New Roman]Theoretical and Applied Genetics. 2006[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]112[/font][font=黑体]：[/font][font=Times New Roman]400[/font][font=黑体]—[/font][font=Times New Roman]409[/font][font=黑体]．[/font][/font][font='Times New Roman'][[/font][font=黑体][font=Times New Roman]9[/font][/font][font='Times New Roman']][/font][font=黑体] [font=黑体]王亮，穆培源，桑伟，等．新疆小麦品种籽粒硬度及[/font][font=Times New Roman]Puroindoline[/font][font=黑体]基因等位变异的分子检测[/font][font=Times New Roman][J][/font][font=黑体]．麦类作物学报。[/font][font=Times New Roman]2010[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]30(1)[/font][font=黑体]：[/font][font=Times New Roman]17-22[/font][font=黑体]．[/font][/font][font='Times New Roman'][[/font][font=黑体][font=Times New Roman]10[/font][/font][font='Times New Roman']][/font][font=黑体] [font=黑体]赵新，王步军．不同硬度小麦品质差异的分析[/font][font=Times New Roman][J][/font][font=黑体]．麦类作物学报，[/font][font=Times New Roman]2009[/font][font=黑体]，[/font][font=Times New Roman]29(2)[/font][font=黑体]：[/font][font=Times New Roman]246[/font][font=黑体]—[/font][font=Times New Roman]251[/font][font=黑体]。[/font][/font]

各位大佬，请问这种垂直上升的信号突变是什么原因造成的条件:安捷伦1260，dad检测器，同一个方法，一个序列中只可能有一针出现也可能一针都没有，我在不同的序列中寻找发现每次出现这种垂直的保留时间都不同，并且不止一台液相有这种情况，，并且压力也正常[img=,690,388]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2020/06/202006101637044347_7090_4134806_3.png[/img]