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益母草与川芎是中药成方制剂中配伍应用频率较高的药对,益母草主要含水苏碱等生物碱类活性成分,川芎主要含阿魏酸等活性成分。对益母草药材及其制剂《中国药典》常以雷氏盐剩余比色法测定益母草总碱含量。在对含益母草及川芎这一药对的制剂进行质量控制时,由于川芎所含生物碱也能与雷氏盐反应生成沉淀,且雷氏盐剩余比色法本身重现性较差,故不宜采用该法。为此,本实验建立了以薄层扫描法测定益母草与川芎合煎液中盐酸水苏碱含量的方法,为制订含有益母草与川芎药对制剂的质量标准提供参考。 1 仪器与试药 CS-9000型双波长薄层扫描仪(日本岛津):939薄层制板器(重庆南岸贝尔德仪器技术厂);定量毛细管(Drummond USA)。盐酸水苏碱对照品(中国药品生物制品检定所,712200105);益母草、川芎(购于安徽毫州)。硅胶G(化学纯,青岛市北区海化干燥剂厂);强酸性阳离子交换树脂(732型,上海化学试剂采购供应站);其余试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 益母草与川芎合煎液的制备 取药材100g(益母草-川芎:1:1),加水煎煮2次,每次2h,每次加12倍量水,合并煎液,滤过,滤液浓缩并定容至100mL,即得合煎液样品。 2.2 对照品溶液的制备 取105℃干燥至恒重的盐酸水苏碱对照品适量,精密称定,加乙醇溶解定容,制成1.2mg/mL的对照品溶液。 2.3 供试品溶液的制备 取合煎液样品适量,离心(4O00r/min)5min后,精密量取上清液lmL置小烧杯中,加蒸馏水1OmL,用稀盐酸调pH 1~2,通过已处理好的强酸性阳离子交换树脂柱(内径1cm,长1Ocm)用水洗至流出液无色,弃去水液,再以乙醇-氨水(8:2)150mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加乙醇溶解,定量转移并定容于lmL容量瓶中,摇匀,作为供试品溶液。 2.4 薄层色谱与扫描条件 吸附剂:硅胶G-O.5%CMC-Na薄层板(厚约0.5mm,105℃活化lh,置干燥器中备用):展开剂:丙酮可-无水乙醇-盐酸(10:6:1) :显色剂:喷以改良碘化铋钾-1%FeC13无水乙醇液(5:1)。,冷风吹至斑点显色清晰。 描方式:双波长反射式锯齿扫描:检测波长:λs=525nm,λR=660nm:狭缝:0.4mm×0.4mm: 线形参数SX=3。 2.5 标准曲线的制备 分别精密吸取盐酸水苏碱对照品溶液4.0、6.0、8.0、10.0、12.0μL,分别点于同一薄层板 ,依上述条件展丌,显色,在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板,周围用胶布吲定,然后扫描测定各斑点的峰面积积分值。以峰面积积分值(A)对点样量(C)进行回归,得回归方程:A=-37152.7+7579.18C‘r=O.9986。表明在4.8~14.4μg范围内盐酸水苏碱斑点峰面积积分值与点样量呈良好的线性关系。 2.6 稳定性考察 取供试品溶液5μL点样,依上述条件展开,显色,在1h内每隔10min扫描测定1次,结果斑点峰面积积分值RSD为4.6%(n=6),表明斑点在显色后1h内基本稳定。 2.7 精密度考察 精密吸取供试品溶液在同一薄层板上点相同量5点,每点5μL,按上述条件展开,显色,扫描测定,斑点峰面积秋分值RSD为1.33%(n=5),对其中一点连续扫描测定5次,斑点峰面积积分值RSD为0.62%(n=5),表明同板精密度和仪器精密度较好。 2.8 异板精密度试验 取薄层板3块,在每1块薄层板二分别点对照品溶液4、6μL及供试品溶液5μL,依法展开,显色,扫描测定,采用外标两点法计算含量。结果测得供试品溶液中水苏碱含量为1.1308 mg/mL(RSD=3.01%)。 2.9 回收率测定 精密量取已知含量的合煎液样品0.5mL,加入盐酸水苏碱对照品溶液0.5mL,混匀后,按2.3项方法制备供试品溶液。精密吸取供试液5μL,对照品溶液4、6μL,变又点样于同一薄层板上,按上述条件展开、显色、扫描测定,用外标两点法计算。 2.10 样品测定 取合煎液样品,按2.3项 方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液5μL,对照品溶液4、6μL,分别交叉点于同一薄层板上,按上述条件展开,显色,扫描测定,用外标两点法计算样品中盐酸水苏碱的含量。 3 讨论 在供试品溶液制备中,以甲醇-氨水(8:2) 或乙醇-氨水(8:2) 作洗脱剂,提纯效果均较好。因乙醇比甲醇价廉且安全,建议采用乙醇-氨水(8:2)作为洗脱剂。本实验对洗脱剂用量考察结果表明,用14OmL即可将盐酸水苏碱洗脱完全。为了保证洗脱充分,本实验中确定用150mL洗脱。 盐酸水苏碱为水溶件物质,在薄层板上显色时受湿度影响很大。通过实验考察,优选出其较好的显色方式为:展开后,取出,晾干,丁105℃烘lOmin,再喷显色剂,冷风吹至斑点色清晰。 益母草有效成分水苏碱含量较低且波动大,容易造成含益母草的制剂有效成分低、产品质量不稳定 ,应增加水苏碱含量控制项目。本实验建立的含量测定方法可为制订含益母草及川芎制剂中水苏碱的定量标准提供参考。参考文献:[1]国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京:化学工业出版社,2000.237,455,564.[2]张玲,时延增,于宗渊,等.舣波长薄层扫描法测定益母草LJ服液中水苏碱的含量[J].中国药科大学学报,1996,27(1):16—18.[3]张玲, 宗渊,李国宝,等.7种含益母草中成药中水苏碱的含量测定[J].药物分析杂志,1996,16(3):181—183.
[b]小序:益母草中盐酸水苏碱含量测定采用的是蒸发光检测器,蒸发光检测器受气体纯度及流动相影响较大,样品复杂,检测器容易被污染,实验室建立了另外一种上机条件与大家分享。[/b]1 材 料 益母草药材(送检样);乙醇(分析纯),乙腈(色谱级),乙酸;[color=#333333]盐酸水苏碱[/color][color=#333333]对照品[/color][color=#333333](购自中检院[/color][color=#333333])[/color]。[color=#333333]2 仪器与设备[/color][color=#333333] 岛津液相LC-20AT[/color][color=#333333]配制奥泰ELSD蒸发光检测器,安捷伦1260 InfinityII 色谱仪,[/color][color=#333333]色谱柱安捷伦[/color][color=#333333]Hilic plus (10[/color][color=#333333]0mm*4.6μm*[/color][color=#333333]3.5[/color][color=#333333]μm);[/color]DZKW-S-6型电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗器械仪器有限公司)。[color=#333333]3 实验方法[/color][color=#333333]3.1 色谱条件[/color][color=#333333] [/color][color=#333333] 条件1:紫外检测器,[/color][color=#333333]波长192nm(末端吸收),[/color][color=#333333]流动相:乙腈:[/color][color=#333333]水(80:20),[/color][color=#333333]柱温35℃,[/color][color=#333333]进样量:5[/color][color=#333333]μL;[/color][color=#333333] 条件2:蒸发光检测器,漂移管温度105[/color][color=#333333]℃,载气(氮气)流速:2.5L/min,流动相:[/color][color=#333333]乙腈:0.2%冰醋酸溶液[/color][color=#333333](80:20)。[/color][color=#333333]3.1 对照品溶液的制备[/color][color=#333333] 取盐酸水苏碱对照品适量,精密称定,加70%乙醇制成每1ml含[/color][color=#333333]0.6 [/color][color=#333333]mg的溶液,即得[/color][align=center][color=#333333][img=,569,165]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907231136427972_5007_1858223_3.png!w569x165.jpg[/img][/color][/align][align=center][color=#333333]图1 盐酸水苏碱标品紫外检测器色谱图[/color][/align][align=center][color=#333333][img=,586,192]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907231137411988_3077_1858223_3.png!w586x192.jpg[/img][/color][/align][align=center][color=#333333][color=#333333]图2 盐酸水苏碱标品蒸发光检测器色谱图[/color][/color][/align][color=#333333]3.2 供试品溶液的制备 [/color][color=#333333] 取本品粉末(过三号筛)约1[/color][color=#333333] [/color][color=#333333]g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%乙醇25[/color][color=#333333] [/color][color=#333333]m[/color][color=#333333]L[/color][color=#333333],称定重量,加热回流2小时,放冷,再称定重量,用70%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。[/color][align=center][color=#333333][img=,578,172]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907231138187006_8379_1858223_3.png!w578x172.jpg[/img][/color][/align][align=center][color=#333333]图3 益母草样品紫外检测器色谱图[/color][/align][align=center][color=#333333][img=,549,161]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907231139006558_7913_1858223_3.png!w549x161.jpg[/img][/color][/align][align=center][color=#333333][color=#333333]图4 益母草样品蒸发光检测器色谱图[/color][/color][/align]4 结果与讨论 两种检测器测得的结果一致性良好,蒸发光检测器需要氮气做为载气,为了节约成本我们开发用紫外检测器进行检测,波长虽然是末端吸收容易受杂质干扰,但是选择合适的流动相比例有利于去除这些杂质干扰,使样品中的盐酸水苏碱得到很好的分离,并且可以准确定量。
问题好多,烦请各位老师认真看一下益母草颗粒或益母草膏中盐酸水苏碱含量测定,色谱条件:乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钾-磷酸(15:85:0.15)为流动相。色谱柱为Biobasic SCX,Thremofisher公司的。液相色谱仪为赛默飞世尔U3000高效液相色谱仪。柱温30,流速1.0ml/min。检测波长为192nm,在此条件下检测不出色谱峰,后将0.05mol/l的磷酸二氢钾改为0.03mol/l的浓度,结果出峰了,但峰的分离效果不好图1是对照的色谱峰,对照是用甲醇配制的,然后我进了一针甲醇的空白结果如图2可以看出加了对照后,第一个色谱峰变大,后面多了一个峰,不过没分开。为了确认该峰是否为要的峰,我在对照品溶液中又加了一点对照品,结果如图3前后两个峰都变大,郁闷死我了。。。。。。。。。。。期间也调低了流速,调低了柱温,更改了流动相中乙腈的比例,结果都不理想,后来将0.05mol/l的磷酸二氢钾改为0.01mol/l的浓度,对照品的峰可以比较明显的分出来了,如图4但是峰形不好,本想这样将就用着的,后来在这个对照中加入一点对照品后,前后峰的面积又都变大了。峰如下图5这是什么原因呢?是盐酸水苏碱溶解在甲醇中产生了什么反应么?为什么甲醇中也有那个色谱峰呢?之后我决定进样品,益母草颗粒,称一克,用0.5%的盐酸甲醇溶液25ml超声30min,进样后结果如图6问题好多啊,为什么对照峰前拖尾,样品峰后拖尾?还有样品我也尝试了那些方法,都没有使峰很好的分离出来,样品该怎么分离好呢?还得调磷酸二氢钾浓度么?之前看到网上有很多说用乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钾-磷酸(15:85:0.15)的流动相做出结果的,为什么我的做不出来,要换成0.01mol/l的呢?[img=,690,417]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131150569283_4003_1791505_3.png!w690x417.jpg[/img][img=,690,422]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131150586305_6177_1791505_3.png!w690x422.jpg[/img][img=,690,426]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131151014335_4399_1791505_3.png!w690x426.jpg[/img][img=,690,428]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131151040285_6173_1791505_3.png!w690x428.jpg[/img][img=,690,420]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131151065795_1809_1791505_3.png!w690x420.jpg[/img][img=,690,413]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131151088295_2442_1791505_3.png!w690x413.jpg[/img]