羟高铁血红素

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在Journal of The American Chemical Society上的文章，A Chemical Proteomic Map of Heme−Protein Interactions1。该文章的通讯作者是美国斯克利普斯研究所的Christopher G. Parker研究员。高铁血红素（heme）是人体中许多蛋白质的辅助因子，也是血液中氧气的主要转运体。最近的研究也证实了高铁血红素可以作为一种信号分子，通过与伴侣蛋白质结合而不是通过其金属中心反应来发挥其作用。然而，目前关于血红素结合蛋白的注释还不够完整。因此，本文采用化学蛋白质组学的方法去揭示人体中与高铁血红素发生互作的蛋白质谱。化学蛋白质组学是揭示蛋白质功能和发现药物靶标的重要工具。其中，最常用的是基于活性的蛋白质分析（Activity-based protein profiling，ABPP），通过结合活性分子探针标记及串联质谱分析，实现对靶标蛋白的鉴定。如图1b，本文设计了一个“全功能”活性分子探针（HPAP），共包含3个部分：1. Hemin母核，用于与靶蛋白非共价结合；2.光活化基团-双吖丙啶，可在UV光照下生成卡宾，促使分子探针与蛋白发生共价交联；3. 炔基，可在铜催化下与含有叠氮的试剂（荧光标签，生物素）发生点击化学反应，后两者组成FF-control。具体实验流程如下图1a所示，用HPAP处理不同细胞（In Situ）或不同细胞来源的蛋白质组（In vitro），HPAP中的hemin母核可与靶蛋白发生非共价结合，经UV光照，HPAP-蛋白间形成共价交联，再利用点击化学可将HPAP-蛋白与荧光素（TAMRA）或者生物素标签相连，用于后续的荧光成像（In-gel fluorescence）或者链霉亲和素纯化、LC-MS鉴别定量（MS-based I.D. and quantitation）。 图1. (a)使用基于高铁血红素的光亲和探针(HPAP)识别血红素结合蛋白的流程示意图。(b) HPAP、hemin和FF-control的结构；(c) HEK293T裂解物中与HPAP结合的蛋白的荧光成像；(d) hemin加入对HPAP与蛋白结合的影响。作者首先使用了SDS-PAGE去评估了HPAP标记蛋白的能力。如图1c所示，随着HPAP浓度的提高，胶图上条带颜色也逐渐加深，说明HEK293T细胞裂解液中与HPAP结合的蛋白在逐渐增加。如图1d所示，在10 μM HPAP的条件下，逐渐加入hemin，可以看到胶图上条带颜色逐渐变浅，说明hemin与HPAP之间发生了竞争，HPAP模拟了hemin与蛋白的结合过程。随后，作者又使用已知的hemin结合蛋白来确认HPAP捕获目标蛋白的能力。如图2所示，这些已知蛋白被HPAP成功的标记上，但由于hemin的加入，条带的颜色在逐渐变浅（TAMRA）。Western blot的结果显示，蛋白的总量并无太大变化，但hemin的竞争结合，导致与HPAP结合的蛋白量在下降。以上实验均说明，HPAP具有较好的选择性标记能力，能够模拟hemin与靶蛋白的结合，并以共价交联的方式标记在蛋白上。 图2. 用已知的高铁血红素结合蛋白确认HPAP捕获目标蛋白的能力。验证了方法的可行性后，作者将HPAP与定量蛋白质组学结合用于绘制高铁血红素-蛋白质互作谱。考察了多种细胞系，包括：人胚胎肾细胞（HEK293T）、人慢性髓系白血病细胞（K562）以及人原代外周血单个核细胞（PBMCs）。每种细胞系设置了两种实验形式：1）特异性结合实验（Enrichment）：通过将HPAP识别出蛋白与FF-Control识别出的蛋白进行对比，排除非特异结合的干扰（图1b），如果同一蛋白通过HPAP富集到的量是FF-control富集到的量4倍以上，则认为该蛋白是HPAP特异性结合蛋白。2）竞争性结合实验(Competition)：观察HPAP富集的蛋白在hemin和HPAP同时存在时富集到的量的变化，变化大于3倍且具有显著性差异（p＜0.05)的蛋白被认为是HPAP与hemin竞争性结合的蛋白。最终确定的高铁血红素结合蛋白应满足以上两种实验的筛选标准(图3a)。如图3b-d所示，总共鉴定出378个的高铁血红素结合蛋白，其中214个来自HEK293T, 182个来自K562, 107个来自PBMC。尽管三种细胞类型之间的结合蛋白有一些重叠，但大多数靶点蛋白只存在于一种或两种细胞类型中(图3b)，这暗示血红素在不同细胞中可能发挥不同的功能。其中，19个靶点蛋白是在UniProt上已经注释为高铁血红素的结合蛋白，剩余都是未揭示的结合蛋白。这些结合蛋白按照功能可划分为：转运蛋白，转录因子，支架蛋白和酶（图3c），根据代谢通路又可进一步划分（图3d）。作者最后对几个新发现的结合蛋白进行了验证，并选择IRKA1进行进一步的作用机制研究。IRKA1在调节炎症信号通路中起着关键作用，IRAK1被IRAK4磷酸化，然后自磷酸化，产生NFkB介导的炎症反应。经实验确认（图4），hemin是IRKA1的一种变构活化配体，可增强其酶活性，促进IRAK1的自磷酸化。 图3. 基于蛋白质组学的HPAP-蛋白互作分析。 图4. Hemin对IRKA1的调节作用。总之，本文设计开发了一种基于高铁血红素的光亲和探针，它可以与化学蛋白质组工作流程结合，以识别不同蛋白质组中的高铁血红素结合蛋白。利用该方法也可拓展至其他分子配体靶标蛋白的识别。 撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：A Chemical Proteomic Map of Heme-Protein Interactions参考文献1. Homan, R. A., Jadhav, A. M., Conway, L. P., & Parker, C. G. (2022). A Chemical Proteomic Map of Heme-Protein Interactions. Journal of the American Chemical Society, 144(33), 15013–15019.

预存多赠5% 还有生活大礼！给自己预定一个创新的机会NMT作为生命科学底层核心技术，是建立活体创新科研平台的必备技术。2005年~2020年，NMT已扎根中国15年。2020年，中国NMT销往瑞士苏黎世大学，正式打开欧洲市场。崔瑾往期NMT成果：NMT主导钙依赖的活性氧信号介导富氢水促根系拒镉的研究基本信息主题：血红素加氧酶诱导剂抑制BcIRT1转录降低小白菜Cd吸收期刊：Environmental Pollution影响因子：6.792研究使用平台：NMT重金属创新平台标题：Hemin-decreased cadmium uptake in pak choi (Brassica chinensis L.)seedlings is heme oxygenase-1 dependent and relies on its by-products ferrous iron and carbon monoxide作者：南京农业大学崔瑾、苏娜娜检测离子/分子指标Cd2+检测样品小白菜根伸长区（距根尖8 mm根表上的点）和成熟区（距根尖16 mm根表上的点）摘要镉（Cd）是农田中的主要污染物，不仅极大地限制了农作物的生产，而且通过进入食物链还会给人类健康带来严重威胁。之前的研究表明，hemin处理可以减少小白菜幼苗中Cd的积累，然而其机制还不清楚。本研究使用非损伤微测技术（NMT）实时监测小白菜根部Cd2+流速，证明hemin处理可以降低植物对Cd的吸收，而不是Cd在植物体内发生转移。此外，研究通过比较小白菜幼苗、野生型拟南芥及heme oxygenase-1（HO-1）突变体对不同化学处理的反应，证据了hemin是以HO-1依赖的方式降低Cd的吸收。此外，对hemin降解产物的分析表明，hemin对Cd吸收抑制可能通过抑制菜根中Fe2+/Cd2+转运体BcIRT1的表达来实现的。离子/分子流实验处理方法① 3日龄幼苗，10 μM hemin预处理1 d再用20 μM CdCl2处理20 min（hemin/Cd），对照为仅用20 μM CdCl2处理，不施加hemin预处理（-/Cd）② 3日龄幼苗用无、10 μM hemin或10 μM ZnPP预处理1 d，用20 μM CdCl2处理20 min③ 3日龄幼苗用无、10 μM Fe2+、10 μM CORM-3或10 μM BR预处理1 d，用20 μM CdCl2处理20 min离子/分子流实验结果采用NMT技术测定了小白菜根表面Cd2+流速的变化，探讨了氯化血红素（hemin）处理后，小白菜幼苗Cd含量是否由于Cd吸收减少而降低。在Cd胁迫下，小白菜根尖迅速吸收Cd2+，在伸长区的内流速率高于成熟区（图1E和G）。与对照组相比，氯化血红素预处理显著减少了Cd2+的内流，在伸长区和成熟区分别平均减少17.4%和18.5%（图1F和H）。因此，在Cd胁迫下，hemin处理降低了Cd的吸收，而不是Cd的运输。图1. Hemin预处理对小白菜根尖不同区域的Cd2+净流速的影响ZnPP预处理的小白菜幼苗根部Cd2+吸收速率在伸长区和成熟区分别显著提升了17.6%和6.5%（图2）。图2.Hemin或ZnPP预处理对小白菜根尖不同区域的Cd2+净流速的影响如图3所示，CO和Fe2+预处理显著降低了根系伸长区和成熟区对Cd的吸收。与该结果一致的是，CO和Fe2+预处理的幼苗中积累的Cd较少（图3）。相反，BR预处理呈现出与非预处理幼苗类似的Cd内流速率（图3）。综上，hemin降解的副产物CO和Fe2+可能是通过抑制Cd的吸收共同促进了Cd的耐受。图3. Fe2+、10 μM CORM-3或10 μM BR预处理对小白菜根尖不同区域的Cd2+净流速的影响其他实验结果与单纯Cd处理相比，hemin+Cd的处理显著降低了所有被测组织（地上部分、茎、叶等）中的Cd浓度。施用hemin并不影响Cd在整个植株体内的转移系数（translocation factor）。ZnPP可以消除hemin对BcHO-1表达的诱导作用。hemin+ZnPP的预处理未能消除Cd胁迫的影响，至少没有达到hemin单独预处理的程度。因此，hemin在Cd耐受性中的积极作用很可能依赖于HO-1活性。hemin增强的HO-1依赖的Cd耐受性似乎在不同植物物种中具有保守性。hemin降解产物（CO、Fe2+和BR）对Cd胁迫下植物生长的保护作用可能与hemin相似。Cd胁迫和ZnPP预处理显著诱导BcITR1转录，而hemin、Fe2+和CO预处理抑制了BcITR1的表达。结论本研究发现，外源hemin的施用通过HO-1依赖的方式减少Cd的吸收，提高了Cd的耐受性。抑制Cd的吸收可能是依赖hemin的副产物Fe2+和CO，通过抑制BcIRT1转录来实现的。离子流实验使用的测试液0.02 mM CdCl2 , 0.1 mM KCl , 0.3 mM MES , pH 6.0文章原文：https://doi.org/10.1016/j.envpol.2020.115882

1.氰化高铁血红蛋白HiCN测定法：除SHb外推荐参考方法，具有操作简单、显色快、结果稳定可靠、读取吸光度后可直接定值等优点。致命的弱点是氰-化钾(KCN)试剂有剧-毒，使用管理不当可造成公害。氰化高铁血红蛋白测定法操作(1)直接测定法①加转化液：试管内加5ml?HiCN转化液②采血与转化：取全血20μl，加到盛有转化液的试管底部，用上清液反复冲洗吸管3次，充分混合，静置5min。③测定：以符合WH0标准的分光光度计，波长540nm处，光径(比色杯内径)1.000cm，HiCN转化液或蒸馏水调零，测定吸光度(A)。④计算：根据样本的吸光度(A)直接计算出血红蛋白浓度(g/L)(A为测定管吸光度，44为毫摩尔消光系数，64458/1000为1mol/L Hb溶液中所含Hb克数，251为稀释倍数。)(2)HiCN标准液比色法测定HiCN参考液(50g/L、100g/L、150g/L、200g/L)，分别测得540nm处的吸光度，以参考液血红蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线或求出K值。①标准曲线绘制和K值计算②样本吸光度③通过标准曲线查出样本血红蛋白浓度，或用K值计算，血红蛋白浓度Hb(g/L)=K×A。 注意事项(1)HiCN贮存：转化液贮存在棕色有塞玻璃瓶中，不能贮存在塑料瓶中，否则会使CN-丢失，测定结果偏低。HiCN转化液在4℃保存一般可数月，不能在0℃以下保存，因为结冰可使高铁氰-化钾还原，试剂失效。(2)标本：异常血浆蛋白质、高脂血症、白细胞数超过30×109/L、脂滴等可产生浊度，干扰Hb测定。(3)HiCN转化液是一种低离子强度、pH近中性的溶液(7.2±0.2)。样本中白细胞过高或球蛋白异常增高时，HiCN比色液会出现浑浊。(4)氰-化钾试剂是剧，测定后的废液应收集于广口容器中，首先以水稀释废液(1:1)，再按每升上述稀释液加次氯酸钠35ml，充分混匀，敞开容器，放置15h以上，使CN-氧化成C02和N2挥发，或水解成C032-和NH4+，再排入下水道。废液不能直接与酸性溶液混合，因为氰化-钾遇酸可产生剧毒的氰氢酸气体。2.十二烷基-硫酸钠血红蛋白SDS测定法：具有操作简单、呈色稳定、准确性和精-确性符合要求、无公害等优点。但由于摩尔消光系数尚未最后确认，不能直接用吸光度计算Hb浓度，而且SDS试剂本身质量差异较大，会影响检测结果。3.HiN3最大吸收峰542nm，显色快，结果稳定。