生物质谱

1、微生物质谱到底是个啥？提到“微生物质谱”，不妨把这一词组拆开来看，“微生物”大家都懂，就不多说了，那么“质谱”到底是啥？质谱分析是一种通过测量离子质荷比（质量-电荷比），从而确定其质量的分析方法（通俗点讲，质谱就是一种类型的“秤”，只不过它称量的是离子的质量），在众多的分析测试方法中被认为是一种同时具备高特异性和高灵敏度且得到了广泛应用的普适性方法。质谱仪器一般由进样系统、离子源、质量分析器、检测器、数据处理系统等部分组成。由于进样方式、离子源、质量分析器等的不同，质谱仪分为不同的种类，临床上常见的有液相色谱串联质谱（LC-MS-MS）、气相色谱串联质谱（GC-MS-MS）、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）等等。我们通常所提到的微生物质谱法采用的就是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术对微生物进行鉴定的方法。MALDI-TOF MS的离子化方式是基质辅助激光解吸电离（MALDI），是一种“软电离”的方式，这种电离方式可以产生稳定的分子离子，因而是检测生物大分子的有效方法，广泛地运用于生物化学，尤其对蛋白质、核酸的分析研究已经取得了突破性进展。图. MALDI-TOF MS的仪器结构那么，MALDI-TOF MS是如何进行样本检测的呢？首先，用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，与样品之间发生电荷转移使得样品分子电离。离子在高压电场作用下加速进入飞行管中，小离子飞得快，先到达探测器，大离子飞得慢，后到达探测器，从而得出测定结果。图. MALDI-TOF MS的工作原理2、质谱为什么能够鉴定微生物？以细菌为例，细菌是原核生物的一类，是一类形状细短，结构简单，多以二分裂方式进行繁殖的原核生物，是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。细菌主要由细胞膜、细胞质、核质体等部分构成，有的细菌还有荚膜、鞭毛、菌毛等特殊结构。图. 细菌结构MALDI-TOF MS之所以能够对细菌进行鉴定，是因为细菌的核糖体蛋白具有保守性，一般不会随生长条件的变化而变化，而不同细菌的核糖体蛋白指纹图谱具有各异性，指纹图谱中的某些峰具有属、种，甚至亚种特异性。另外，同种细菌在同一培养条件下生长，所得到的质谱结果具有可重复性，这使得MALDI-TOF MS鉴定细菌结果更加准确。肠杆菌的质谱图结核分枝杆菌的质谱图图. 不同菌种的蛋白指纹图谱MALDI-TOF MS鉴定细菌基本流程是，将细菌纯培养后，点靶加释放液，细菌经过释放液充分处理后，可使得细胞内的蛋白成分更好地释放出来，待溶剂挥发后加基质，蛋白分子与基质形成基质结晶，上质谱检测。在质谱仪中，样品通过有效的电离将不同质荷比（m/z）的离子分开形成细菌特异性的清晰的指纹图谱，通过分析关键的质谱峰数据，与数据库中的已知菌种谱图进行比对，即可快速得到细菌鉴定结果。图. 微生物质谱鉴定操作流程3、为什么要用质谱做微生物鉴定？那么，为什么要用质谱做微生物鉴定，而不是别的方法？这就要先来说一说目前的微生物鉴定方法。目前微生物鉴定常用的方法为生化原理检测，即先判断革兰氏阴性还是阳性，再根据形态、酶反应、显色等不同方法，将具体微生物种类鉴定出来。对于绝大多数的微生物检测有一个绕不开的环节，那就是标本处理和培养。需要首先对样本进行预处理，根据涂片染色的结果选择合适的培养基分离培养，然后根据菌落特点，选择适当的生化反应或者自动仪器鉴定。然而，生化法微生物检测样品培养时间长，短到几小时，长到几天都有可能；只能鉴定常规菌种，准确度一般；另外，就是鉴定流程较复杂，离不开人工干预，耗时长（十几个小时甚至更长时间）。由于鉴定原理的不同，微生物质谱法可大大简化微生物的鉴定流程，缩短鉴定时间，上机之后，基本10min之内就可以鉴定出96个样本，称得上是一种微生物快速鉴定方法。理论上，微生物质谱的数据库可以无限大（当然这也只是在理论上）。目前市面上的微生物质谱产品数据库少则含有2000余种微生物，多的也有超4500余种的（例如融智生物的QuanID微生物质谱系统），远远大于生化法的数据库种类。而且，数据库可扩展，用户可根据需要自建库。 图. QuanID微生物质谱系统另外，而且是最重要的一点，就是微生物质谱鉴定的准确性高。除了得益于超大的数据库外，质谱硬件的性能也是鉴定准确性的保证。QuanID微生物质谱系统依托于融智生物新一代宽谱定量飞行时间质谱平台QuanTOF（新一代的MALDI-TOF MS），检测质量范围更宽（10-1000,000Da），重现性更高（SD＜5%），保证了微生物鉴定结果的高准确性。此外，QuanID微生物质谱系统的数据库还有一个独特之处，就是分为一级、二级两个数据库，二级菌库涵盖100多种相似病原体，可对基因型相近的难分辨微生物（如：大肠杆菌和志贺氏菌等）做出准确鉴定。（详见：QuanID突破微生物质谱鉴定的局限性）怎么样，这3个问题有没有让你对微生物质谱有了全面的了解呢？

近日，国家卫健委对《临床微生物检验基本技术要求》卫生标准征求意见。该征求意见稿规定了临床微生物学（细菌学、真菌学）检验基本技术的要求，适用于开展临床微生物学检验的各级医疗机构及其临床微生物学实验室。小融了解到，征求意见稿中对微生物鉴定技术进行了规范，其中就包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定技术。征求意见稿首先对MALDI-TOF MS技术鉴定微生物给予了肯定，指出MALDI-TOF MS鉴定系统扩展了对常见菌、苛养菌、厌氧菌、丝状真菌以及分枝杆菌、奴卡菌等难鉴定微生物的鉴定谱，目前数据库可鉴定300多个属2000余种菌，远高于自动化、半自动化鉴定系统及手工鉴定方法。然而，并没有一种鉴定方法是完美的，每种方法都有自身的局限性。征求意见稿也指出了MALDI-TOF MS鉴定技术的局限性，即系统数据库的完整程度，包括覆盖的菌种数、每种菌所用的建库菌株数量和来源、以及图谱采集的质量，都会造成鉴定性能的差异，导致对大肠埃希氏菌和志贺氏菌属、沙门氏菌属、肺炎链球菌和缓症链球菌群等等给出错误的鉴定结果。图片来源于：国家卫健委，《临床微生物检验基本技术要求》征求意见稿有这样的局限性，MALDI-TOF MS技术用于微生物鉴定，还香吗？别慌，新一代的MALDI-TOF MS来破局！硬件加持，QuanID微生物质谱更准确融智生物致力于将高端生命科学仪器推向临床实际应用中，研发的新一代宽谱定量飞行时间质谱平台QuanTOF（新一代MALDI-TOF MS），采用了自主知识产权的离子源与探测器电耦合技术，结合更高频率、更高精度的半导体激光解析电离系统及全新设计的混合探测器，实现了MALDI-TOF MS革命性的技术创新。QuanTOF在世界上首次实现在宽质量范围内（10-1000,000Da）保持较高分辨率和灵敏度（中国分析测试协会2019年验证结果，10fmol信噪比大于200，BSA），全扫描范围内的高重现性，使得其可满足定量应用，且定量精度达95%以上，远高于传统MALDI-TOF MS仪器。也就是说，在硬件方面，QuanTOF质谱平台的强大性能决定了以此为依托的QuanID微生物质谱系统鉴定结果的高准确性。QuanTOF新一代宽谱定量飞行时间质谱平台数据库出击，QuanID微生物质谱更强大当然了，对于微生物质谱的鉴定结果起到决定性作用的非数据库莫属。传统微生物质谱系统的建库方法是将收集来的菌株进行筛选，用不同培养基进行培养后，上机采集质谱图，建立微生物数据库。这种建库方法选取蛋白质作为建库依据，容易受细菌培养条件的影响，增加了菌库的不确定性。最准确的细菌鉴定方法是基因测序，然后和Gene bank进行比对鉴定。但这种方法耗时、耗财、耗力。QuanID微生物质谱数据库采用正向建库、反向验证的方法进行数据库的建设。先进行基因组测序，然后翻译成蛋白信息，挑选保守稳定的核糖体蛋白和一些对鉴定有意义的结构蛋白，得到其氨基酸序列，计算氨基酸理论分子量，从而建好数据库；最后用质谱采集标准菌株获得的蛋白谱进行数据库验证。QuanID微生物质谱数据库建库步骤QuanID建库方法考虑了生成蛋白过程中氨基酸的各种修饰（如甲基化、乙酰化等），得到的数据库鉴定结果更准确，而且省去了测序的时间和成本。第三方的验证结果表明，QuanID微生物质谱在种水平和属水平鉴定准确率上均优于国际同类产品。微生物质谱鉴定产品间比较，种水平和属水平准确率统计截止到目前，QuanID微生物质谱数据库可对超过500属、4500余种的微生物进行鉴定（可扩展）；拥有一级、二级两个数据库，独有的二级库可对基因型相近的难分辨微生物（如：大肠杆菌和志贺氏菌等）做出准确鉴定，目前已涵盖100多种相似病原体。另外，融智生物还与国内知名菌种保藏机构合作，不断对中国特有的微生物质谱数据库进行完善。以志贺氏菌为例，同类仪器检出结果均报为大肠埃希氏菌，融智生物QuanID 数据库可以直接鉴定到种水平。QuanID微生物质谱系统给出的志贺氏菌鉴定结果QuanID微生物质谱系统给出的大肠埃希氏菌鉴定结果MALDI-TOF MS微生物鉴定方法已经越来越被广泛接受，这也间接说明了其在微生物鉴定方面的巨大优势。虽然微生物质谱技术有其自身的局限性，但是相信随着质谱技术的进步以及微生物数据库的不断完善，其局限性也会趋于消弥。

邀 请 函为积极促进我国生物质谱技术的发展和应用，加强国内外相关研究领域的专家学者之间的交流与合作，将于2014年7月3日在复旦大学举办“全国生物质谱学术报告会--生物质谱前沿技术邀请报告会”。全国生物质谱学术报告会曾在1999年(上海)，2003年（北京），2004年（上海），2009年（上海），2010年（丽江）举行。2014年本次会议由中国人类蛋白质组组织(CNHUPO) 、中国物理学会质谱分会、中国化学会质谱分析专业委员会和复旦大学主办，美国AB Sciex公司协办。本次会议特邀瑞士苏黎世联邦技术学院分子系统生物学研究所Ruedi Aebersold教授、加拿大阿尔伯塔大学Liang Li教授、美国北卡罗来纳大学Xian Chen教授、约翰霍普金斯大学Hui Zhang教授、美国西奈山伊坎医学院Rong Wang教授、中国科学院大连化学物理研究所张玉奎院士、北京蛋白质组研究中心钱小红教授、中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所曾嵘教授、中国科学院北京基因组研究所刘斯奇教授和复旦大学杨芃原教授10名国内外知名专家围绕生物质谱前沿技术和热点问题作专题报告，每个邀请报告的时间为40分钟（含提问时间5～10分钟）。我们真诚地邀请您和您的研究组参加此次会议，本次会议不收会务费，参会者请自行安排住宿，交通和住宿等费用自理，会议提供7月3日的午餐和晚宴。 时间及地点会议时间：2014年7月3日报到时间：08：00-08：30，报到地点：明道楼二楼报告厅大厅 会议地点：复旦大学枫林校区明道楼二楼报告厅（上海徐汇区东安路131号明道楼二楼报告厅），地图请见附件四★ 会议回执：请务必再次填写回执，请见附件二，以供我们安排您的席位！★ 会议议程：请见附件三 会务联系方式徐婷婷: 021-24197312，13917508504，18501662236, tingting.xu@absciex.com方彩云：021-54237961附件一：邀请函（如需要请复制打印） 附件二：会议回执姓名单位是否参加会议(是或否)是否出席晚宴(是或否)附件三：会议议程TimeTitleSpeaker8：00-8：30Registration（明道楼二楼）8:30Welcome and IntroductionPresiding, Dr. Pengyuan Yang, Institutes of Biomendical Sciences, Fudan UniversityPresiding, Dr. Siqi Liu, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences8:35~9:15From Proteome to Proteotype via SWATH-MSBy Dr. RuediAebersold,Institute of Molecular Systems Biology (IMSB) in ETH Zurich9:15~9:55Novel Methods for Proteome QuantificationBy Dr. Yukui Zhang, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences9:55~10:10AB SCIEX New Product Launch10:10~10:20BreakPresiding, Dr. Pengyuan Yang, Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University10:20~11:00Proteomic and GlycoproteomicAnalyses of Tumor Tissues Reveals Altered Glycosylation in Tumor SubtypesBy Dr. Hui Zhang,Johns Hopkins University11:00~11:40Integration of SWATH and MRM for Biomarker Discovery of Esophageal Squamous Cell CarcinomaBy Dr. Siqi Liu, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences11:40~12:20Discovery of Novel Interplaying Signal and Epigenetic Pathways Involved in Cellular Stress ResponsesBy Dr. Xian Chen, University of North Carolina at Chapel Hill12:20LunchPresiding, Dr. XiaohongQian, Beijing Proteome Research Center, China14:00~14:40Integrating Proteomics and Metabolomics: Technical ChallengesBy Dr. Liang Li, University of Alberta14:40~15:20Quantitative Mass Spectrometry to Reveal Dynamics of Metabolic NetworkBy Dr. RongZeng, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences15:20~15:40BreakPresiding, Dr. RongZeng, Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences15:40~16:20Affinity Enrichment Based Strategy for Proteomics AnalysisBy Dr. XiaohongQian, Beijing ProteomeResearch Center, China16:20~17:00Learning Alzheimer' s Disease using Mass SpectrometryBy Dr. RongWang, Icahn School of Medicine at Mount Sinai17:00~17:40Deciphering Glycoform of Site-specific Glycosylation Based on High-throughput CID/HCD MS/MSBy Dr. Pengyuan Yang, Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University18:00Dinner附件四：地铁示意图附件五：附近酒店示意图