微生物培养基

微生物培养基使用中常出现的问题及解答！百欧博伟生物：工作中发现，有部分检验员对培养基的使用存在障碍，借此机会和大家分享讨论一下大家常见的对培养基存在的一些疑问。一、培养基煮沸溶解后再高压灭菌，还是直接高压灭菌存在疑惑。拿麦康凯琼脂举个例子，溶解后灭菌，平板上没有不溶的结晶紫，没有紫色的斑点；相对比未溶解灭菌的，平板上有结晶紫和紫色的斑点。所以正确的做法是先煮沸溶解后再高压灭菌。二、培养基PH值为什么不在标准范围内？其实出现这个情况的问题有很多种，大致我分为这么6大点：1、质量不好（生产厂家出厂时pH就不正确）；2、灭菌问题（高压灭菌温度过高或灭菌时间过长，导致葡萄糖类焦化从而pH降低）；3、保存时间（超过保质期或结块）；4、水质出现问题（可以用去离子水、纯化水、蒸馏水不能用矿泉水、自来水）；5、保存温度（保存温度过高）；6、光线直射总结本人认为以上6点都可能导致培养基pH出现偏差，如果出现此类问题，建议逐一排查，直到问题解决。三、培养基高压灭菌时为什么会焦化？不少检验人员在实验时，发现经过灭菌的培养基有焦化现象，我认为引起此现象的主要原因有以下4点：1、可能你灭菌的时候温度超过了121℃（正常115-116℃20min即可）；2、灭菌时间过长；3、培养基在容器中装的太多（不要超过容器容量的80%）；4、灭完菌的培养基在高温环境中保存的时间过长，这些都会导致培养基发生焦化现象。四、培养基PH怎么测定？通常分两种情况：1、对于无需高压灭菌的培养基，先煮沸溶解后再冷却至25℃时，测定其pH值（固体培养基至少测2个点，取其平均值）；2、对于需要高压灭菌的培养基，高压灭菌后，冷却至25℃测其pH（固体培养基至少测2个点，取其平均值）。五、含琼脂培养基在倒平板为什么有时候不凝固或凝固不好？针对以上情况，我做了分析：1、针对需要高压灭菌的培养基，倒平板时候要先摇匀（因为琼脂分子量比较大，在冷却过程中容易沉淀到底部，导致琼脂分散不均匀）；2、针对无需高压灭菌的培养基，一次煮沸溶解后不能直接倒平板，应重复煮沸溶解3-5次（因为一次不能确保琼脂完全溶解）。六、为什么同一品牌的不同批号，粉末颜色有差别？分析可能有3个原因：1、此培养基成分含有染料或指示剂；2、不同批次粉末培养基含水量不同，一般要求≤6%，含水量越高，颜色越深；3、加工时球磨时间越长颜色越深。北京百欧博伟生物技术有限公司的微生物菌种查询网提供微生物菌种保藏、测序、购买等服务,是中国微生物菌种保藏中心的服务平台，并且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培养基为一体的大型微生物查询类网站，自设设备及技术的微生物菌种保藏中心！欢迎广大客户来询！

微生物检测培养基质量控制问答1、培养基灭菌后成份会有所蒸发减少，如何处理这个问题？答：正常情况下蒸发量较少，可忽略不计。2、培养基融化后出现浑浊是有哪些方面的原因引起的？应如何避免？答：可能的情况有:1. 培养基配置用水不符合规定；2. 灭菌过程温度升温慢或降温慢；3. 培养基储存不当；4. 融化时沸腾时间较长等。3、准备好的培养基有效期如何验证？答：定期取出培养基验证其无菌性，促生长能力等方面。4、培养基配制好灭菌后，在高压容器中保温降至50℃左右，可不可行？答：建议最-好不要，避免过度受热。5、脱水培养基对湿度是否有要求？多少适宜？答：按要求室温干燥环境储存即可。6、培养基pH值测定温度在25℃，这个温度应怎么控制？答：可水浴控制培养基温度。7、配制培养基过程中，按说明书称定量，加规定的纯化水，煮沸溶解，为了避免煮沸过程总减少水分，是否要在配制过程适当增加水?答：可适量增加，自己掌握。8、商品培养基一定要当天配当天用吗？可否在一周内用完？答：不是即配即用的培养基的话，储存的当，可以使用。9、称量培养基时，注意不要吸入粉末，这粉末是指何物？答：就是你所称量的干粉培养基 ，因为培养基的粉末对呼吸道有刺激作用，而且培养基中的某些成分，如亚硒-酸盐、叠氮-化钠、乙酰胺等，长期吸入并在体内累积到一定量会对人体健康有危害。所以培养基配制称量需做好个人防护，且最-好选择少粉尘环保型颗粒培养基。10、煮培养基，用不锈钢锅在电磁炉上煮可行？硫乙醇培养基是否要煮沸？如何煮沸？用不锈钢锅在电磁炉上煮沸可行吗？可不可以水浴煮沸呢？答：硫乙醇应煮沸，量大时，我实验室用不锈钢锅在电磁炉上煮沸。不建议水浴煮沸，因为水浴煮沸琼脂粉很难溶，导致琼脂分装不均匀，前段分装的琼脂含量少，后段分装的琼脂含量高，导致有的管或瓶中的FT凝固。11、如培养基在高压灭菌器中温度需自然下降20度才开盖吗？答：高温灭菌器有安全阀，温度下降到安全阀可打开时将培养基取出室温冷却，各型号灭菌器安全开盖温度不尽相同。12、平板涂布和平板划线培养基表面水分过多，菌落蔓延如何解决？答：对于采用表面接种形式培养的固体培养基，应先对琼脂表面进行干燥：揭开平皿盖，将平板倒扣于烘箱或培养箱中（温度设为25℃～50℃）；或放在有对流的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥。商品化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。

p　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "简介/span/strong/pp　　用于重组蛋白和单克隆抗体(mAb)生产的细胞培养工艺有不同的方式。补料分批(Feb-Batch)工艺由于操作简单，且较易规模放大，被临床和商业化生产广泛采用，目前的技术发展已可在18天内获得20-30x10^6cells/mL的细胞密度，同时获得 10g/L的滴度水平。/pp　　灌流工艺以往更多用于生产不稳定的产品，如血液凝集因子和酶类产品，但也有用于生产 mAb产品，如Remicade(英利昔单抗)。在灌流培养中，通过培养基置换，降低产物在反应器内的滞留时间，而灌流速率取决于特异性的产物和/或工艺需求。/pp　　近几年，在上游工艺中，基于灌流的工艺强化获得了极大的发展，驱动力主要来自于对降低成本和占地的需求，以及提高设备灵活性。随着细胞系、培养基和细胞截留设备的发展，现在的灌流工艺已可获得较高的细胞密度和产量，使其成为一个非常有吸引力的选择，包括mAb的生产。例如，在mAb生产中，结合2vvd的培养基置换速率，通常可达到50-60x10^6cells/mL的稳态细胞密度，以及高达4g/L/day的生物反应器产率。此外，浓缩补料分批(CFB)也可以通过培养基置换，维持高细胞密度，而将产物截留在生物反应器内。/pp　　灌流和CFB的差异在于所用的中空纤维膜的孔径。对于抗体，使用Per.C6细胞系，可在12-13天内，达到21.4g/L的终产物滴度(峰细胞密度 150x10^6cells/mL)，而使用CHO细胞系时，可在16天内达到25.3g/L的滴度，峰细胞密度 180x10^6cells/mL。随着生物反应器产率的提高，可使用占地更小、成本更低的一次性设备，来替代大规模的不锈钢设备(10,000-25,000L)，通过增加设备轮转或连续工艺，生产等量的产物。/pp　　尽管灌流工艺可使用基于过滤的细胞截留设备，如TFF和ATF，在生物反应器内获得并维持高细胞密度，但通常会要求使用较高的培养基置换速率，以将高密度细胞的活性维持在可接受的水平。与不同工艺相关的培养基成本是评估其生产等量产物时经济性的关键因素。而即使单位培养基成本适当，较高的培养基置换速率也会显著影响生产产品成本(CoG)，亦即，上游操作成本与培养基成本紧密相关。/pp　　生产单位产品的总生产CoG和上/下游成本的比重会随产物滴度和设备尺寸的变化而变化。在分析CoG的所有输入值中，一旦工艺确定，培养基用量及其成本是固定的，不管设备、设施等是否发生改变。细胞培养工程师的一个主要目标是降低培养基成本，同时获得高产量。本文使用相同的基础(basal)和补料(feed)培养基，稍作优化，开发了具有高生物反应器产率的不同细胞培养工艺(补料分批、灌流和CFB)，并比较了不同操作模式的生物反应器产率及其相关的培养基成本。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "实验/span/strong/pp　　实验使用生产单克隆抗体的重组CHO细胞系，不同工艺使用相同的3L生物反应器，培养基使用专利的基础(basal)和补液(feed)培养基，后者又分为两种补液-A和补液-B，均富含葡萄糖、氨基酸、维他命等。详细细胞系和种子扩增、生物反应器操作信息请参看原文。/pp　　对于补料分批培养，反应器起始工作体积1.5L，接种密度为0.5或2x10^6cells/mL，后者通过3天的N-1灌流来达到目标密度。生物反应器补液以每日葡萄糖水平为基础进行。/pp　　对于CFB工艺，使用50kD PS中空纤维过滤器的灌流设备，对于灌流，使用0.2μm PES中空纤维过滤器的灌流设备。接种密度1x10^6cells/mL，工作体积1.3L，一般第2天开始培养基置换，最大置换速率1vvd。灌流培养在第8天开始进行细胞废弃(cell bleeding)，以维持所需细胞密度和活性。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/b370cbae-a09d-4aad-901e-9998bacb5c16.jpg" title="1_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "不同细胞培养模式图解(xu et al, 2017)/span/strong/pp　　细胞培养每日取样分析，详细分析内容和方法，请参考原文。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "讨论/span/strong/pp　　不同操作模式的细胞培养性能/pp　　实验测试操作模式包括：补料分批、灌流和CFB，使用相同的3L生物反应器规格以及基础和补料培养基组合，以便比较细胞/生物反应器产率和培养基成本。/pp　　补料分批模式 对于补料分批模式，接种密度为0.5或2x10^6cells/mL，后者通过N-1灌流，可使对数生长期降低2天，所以8天就可达到峰密度，而前者需要10天。两种条件达到的峰细胞密度范围均为20.2-26.2x10^6cells/mL。两种接种密度在第14天分别达到5.4± 0.1g/L和6.8± 0.2g/L的滴度。生物反应器单位体积产率(VPR)按最终生物反应器滴度除以培养周期计算。2x10^6cells/mL接种密度条件，相比0.5x10^6cells/mL，可获得更高的VPR(0.49± 0.01g/L/day vs. 0.39± 0.01g/L/day)，主要是由于前者降低了起始生长阶段的时间，延长了生产期。/pp　　灌流模式 在灌流培养中，使用了2种不同的培养基组成：1种只使用基础培养基，另一种为基础加补液-A。在培养过程中，通过合适的cell bleeding，维持较高的活性 85%。只使用基础培养基时，平均细胞密度为44± 4.1x10^6cells/mL，从第8天至32天的日产量为0.7± 0.04g/L/day。在基础+补液条件中，随细胞密度的增加，补液-A作为培养基置换的一部分，逐渐引入，而总培养基置换率保持为1vvd，平均细胞密度增加至73.9± 5.4x10^6cells/mL，日产量增加至2.29± 0.28g/L/day。细胞特异性产率从16.0± 1.2pg/cell/day增加至30.1± 2.3pg/cell/day，从而使反应器产量增加~230%。/pp　　浓缩补料分批模式(CFB) 与灌流相似，评估了只使用基础培养基和使用基础+补液培养基的条件。与灌流工艺相比，CFB不需要进行cellbleeding，细胞质累积至更高的水平。当只使用基础培养基时，在第18天达到峰细胞密度72.0± 9.6x10^6cells/mL，上清液滴度为12.2± 0.6g/L。使用基础+6%补液-A+2%补液-B时，峰细胞密度为117.4x10^6cells/mL，第18天上清液滴度为21.4g/L，使用基础+8% 补液-A +8% Feed-B时，峰细胞密度为83.4x10^6cells/mL，第18天上清液滴度为36.7g/L。可见，增加补液-A和补液-B的量，可显著提高细胞特异性产率至45.1pg/cell/day。/pp　　细胞特异性产率、生物反应器产率和产物质量/pp　　当只使用基础培养基时，批次、灌流和CFB工艺可达到相似的qP，范围为14.7-17.1pg/cell/day。在此条件下，累积的细胞数量会直接影响产物滴度和单位体积产率。正如预期，批次培养的VPR显著较低，仅为0.08g/L/day，而灌流和CFB工艺由于可维持更高的细胞密度，可获得相当的VPR，0.68-0.70g/L/day。/pp　　浓缩补液培养基通常用于补料分批工艺，以提高细胞生长和细胞特异性产率。在此研究中，补加补液培养基，可显著提高qP和VPR。对于补料分批培养，qP提高至29.4-32.0pg/cell/day，VPR达到0.39g/L/day(接种密度0.5x10^6cells/mL)或0.49g/L/day(接种密度2x10^6cells/mL)。N-1灌流获得的更高的接种密度可提高VPR，因为缩短了生长期的时间，延长了生产期，提高产量。但是，即使与只使用基础培养基的灌流和CFB相比，补料分批培养的VPR仍较低，因为细胞密度差别显著。/pp　　相比补料分批工艺，只使用基础培养基以1vvd的速率进行培养基置换时，可轻松地将细胞密度提高2-3倍。而与只使用基础培养基的条件相比，在灌流培养中补充10%补液-A可使VPR提高~230%，qP提高~90%。相似的，在CFB工艺中，补充不同比例的补液-A和补液-B可将VPR提高至1.19-2.04g/L/day。/pp　　最近有报道显示，长寿命的人浆细胞可在体外维持120pg/cell/day的IgG分泌率，对于基因工程哺乳动物细胞，最高生产速率估计为~100pg/cell/day。qP的提高将来自于细胞系和培养基的优化。所以，理论上，在灌流工艺中，如稳态细胞密度维持为100x10^6cells/mL时，每日产量可高达10g/L/day。/pp　　实验同时评估了不同操作模式的产物质量特征，结果显示，CFB会形成更高水平的HMW和稍高的酸性异构体，主要是由于产物所暴露的细胞培养环境。在补料分批和浓缩补料分批中，产物滞留时间为整个培养周期。此外，在仅使用基础培养基的CFB工艺中，HMW最高，说明培养基组成可能在HMW形成中扮演了重要的角色。但是，产生的HMW仍低于5%，且大部分可在纯化步骤中去除。另一方面，即使是相同的高细胞密度环境和相似的培养基组成，灌流培养的酸性异构体和HMW更低，可能是由于产物在罐内更低的滞留时间。/pp　　培养基成本分析/pp　　由于细胞系或培养基组成的变化会显著影响产物滴度/产率，所以对不同操作模式的比较需使用相同的细胞系和培养基条件才有意义。本文使用从小规模生物反应器获得的细胞培养性能，来比较不同操作模式的培养基成本，并假定在规模放大时，不同工艺没有显著的产率下降。需要指出的是，实验中的灌流速率没有在对数生长期，以细胞特异性为基础，进行良好的优化。相反，在整个培养周期中，将灌流速率固定为1vvd。在不同的培养阶段，对细胞特异性灌流速率进行精细调节，应可进一步降低培养基用量和成本。/pp　　当只使用基础培养基时，生产每克抗体的培养基成本在批量和灌流工艺中都很高。加入适量的补料培养基，可降低每克mAb的培养基成本，且即使补料培养基相对较贵，细胞密度和qP的增加相比培养基成本的增加更加显著。/pp　　使用N-1灌流的补料分批的培养基成本比常规补料分批工艺低，N-1灌流需要3x基础培养基置换，但因接种密度的提高，继而获得的滴度的增加，抵消了培养基用量的增加。N-1灌流的补料分批和灌流的培养基成本相当，~$10/g mAb。这说明，虽然往常认为由于较高的灌流速率，灌流的培养基用量更高，继而培养基成本更高，但只需要生物反应器产率达到一定的阈值，从培养基成本上来看，还是相当有竞争力的。/pp　　CFB工艺的培养基成本与其它操作模式的趋势不同。在只使用基础培养基的条件中，成本与批量和灌流工艺相当，但CFB培养基成本会随补料培养基的使用而增加，其相对较高的培养基成本( $17/g)可能是因为需要较长的细胞生长时间，在培养中，直到第10天，细胞密度达到峰水平，才开始出现显著的产物滴度增加。降低CFB培养基成本的一种方法是优化细胞寿命，延长批次时间，但更长的罐内滞留时间，可能会影响产物质量属性，或是进一步优化培养基，如替换昂贵的成分和优化其滴度。/pp　　总生产COG/pp　　除了培养基成本的不同，使用诸如灌流和CFB之类的工艺，结合一次性设备，在小规模上进行生物制品生产，可显著降低成本投入，从而获得更加灵活的生产策略，当产品需求增加时，可以快速地进行规模扩展(scale out)，而不是规模放大(ScaleuP)。与传统不锈钢设备相关的固定成本，可以转变为“可变”的成本结构。基于此处的案例，灌流工艺的培养基成本实际上低于补料分批工艺。/pp　　进行总成本分析时，如下游均以批量模式进行，且认为不同工艺的劳动力成本相当，则本文建模分析结果显示，N-1灌流的补料分批和灌流工艺的下游CoG/g相当，分别为$63/g和$59/g，而标准补料分批和CFB工艺的下游CoG/g稍高，分别为$71/g和$81/g。对于mAb和不稳定的产品，基于灌流的连续工艺都可以提供显著的经济优势。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "总结/span/strong/pp　　在本研究中，比较了不同操作模式下，生物反应器的产率，包括补料分批、灌流和CFB工艺。对于研究的细胞系，qP高度取决于所用的培养基，不管采用哪种操作模式，这使得累积细胞密度成为决定产物滴度和生物反应器产率的主要因素。结果显示，补料分批培养生物反应器产率最低(0.39-0.49g/L/day)，而基于灌流的培养方式，由于可维持更高的细胞密度，产率相对较高，灌流为2.29g/L/day，CFB为1.19-2.04g/L/day。灌流的一个显著优势是可以达到并维持极高的细胞密度，用于产物形成。/pp　　灌流工艺一个经常观察到的缺点是培养基用量较高，因为需要进行连续的培养基置换，以维持所需的高活细胞密度。这里的研究显示，高产率灌流培养的培养基成本实际上低于补料分批工艺。CFB工艺的培养基成本最高，虽然在18天内达到了36.7g/L的极高滴度，为降低CFB工艺的培养基成本，建议可以精调培养基置换率，以在起始的生长阶段获得更好的培养基利用，或通过培养基优化，提高细胞特异性产率。/pp　　i小编出于交流目的编译此文，由于水平有限，不当之处，敬请谅解，详细内容，请参看原文。/i/ppi　　原文：S.Xu, J.Gavin, R. Jiang, et al., Bioreactor Productivity and Media Cost Comparison for Different Intensified Cell Culture Processes. Biotechnol. Prog., 2017, Vol. 00, No.00./i/ppbr//p