谷胱甘肽还原酶

近日，中国科学院精密测量科学与技术创新研究院研究员周欣研究团队设计构建了一种双模态分子探针氟化硝基Cy7，实现了活体肺癌中硝基还原酶的19F 磁共振和近红外荧光精准成像。相关研究成果发表在《德国应用化学》（Angew. Chem. Int. Ed.）上，并被遴选为本期的VIP（Very Important Paper）。 　　硝基还原酶（NTR）是一种重要的生物标志物，广泛用于评价肿瘤缺氧程度。虽然已经有一些光学成像方法用于硝基还原酶的活体成像，然而组织穿透深度及定量浓度较低等缺点限制其在临床诊断中的广泛应用。19F MRI可直接检测19F原子核信号，且活体成像中无背景信号干扰，信号强度与外源性探针的浓度成正比，有潜力成为传统1H MRI在临床应用中的互补新技术。在该体系中，FCy7-NO2不仅可以作为一种快速响应的近红外荧光增强探针用于监测肺癌中的硝基还原酶，并且利用该分子的19F MRI化学位移敏感特性，可选择性地针对深层次肺癌中的硝基还原酶进行活体成像。　　 　　该研究提出的利用19F磁共振/荧光双模态成像技术用于肿瘤中硝基还原酶的精准成像及定量分析方法可为肿瘤标记物的精确诊断提供重要工具。同时，根据硝基还原酶的含量可用于区分正常和缺氧肿瘤组织，定量评估缺氧程度，有望为生物医学领域提供新方法和新技术。　　 　　研究工作得到国家科技部、国家自然科学基金委和中科院的支持。　 图1.探针可在较宽浓度范围内灵敏地检测活体肺癌中的硝基还原酶的变化。　 图2.FCy7-NO2可通过近红外荧光和19F MR化学位移成像识别精准原位肺癌。

无味无毒的气体一氧化二氮（N2O，nitrous oxide）可以通过生物和非生物两类过程形成，这导致大气中 N2O 浓度每年稳定增加 0.2-0.3 %。一氧化二氮是一种消耗臭氧的物质；它的全球变暖潜力超过了二氧化碳的 300 倍，因此已经被认为是 21 世纪最关键的人为排放物。微生物可以将 N2O 转化为 N2，这是反硝化过程的最后一步，这一反应完全由一氧化二氮还原酶（N2OR 酶）催化。大气中 N2O 释放和不断积累的一个主要因素是，在高流量氮的环境下，微生物还原 N2O 的能力有限。因此，利用 N2OR 酶的性能进行农业或生物修复应用是相当有意义的，这需要对该酶及其反应过程有一个详细的了解。除了 [ 4Cu:2S ] CuZ 簇，它还含有混合价的双铜电子转移中心 CuA，这使其成为目前已知最复杂的含铜酶。各种真核生物和原核生物酶在涉及氧运输、电子转移或氧化还原催化的过程中都会使用过渡金属铜，但其巨大的细胞毒性、对铁硫簇代谢的不利影响以及产生活性氧的倾向性，使得细胞内必须进行严格的平衡和调节。N2O 还原剂通过完全在细胞质外组装 CuA 和 CuZ 来规避与细胞内铜有关的风险，尽管 apo-N2OR 已经以折叠状态通过 Tat 途径被输出。然而，这种策略导致了新的复杂情况，特别是包括在周质中没有还原当量和高能化合物，如核苷三磷酸酯。I 族 N2O 还 原催化剂的共同结构包括两个核苷酸结合结构域（NosF）和两个跨膜结构域（NosY）。一些细菌输出体进一步与附属蛋白相互作用，以建立复杂的运输系统，NosD 蛋白被认为是与 NosFY 一起发挥这种作用。由于 NosDFY 的实际货物分子尚未被确定，不能排除 CuZ 成熟所需的周质硫源。为了了解 N2OR 成熟的分子基础，这项研究制作并表征了 NosDFY 复合物，并通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）研究了它与 NosL 和 N2OR 的相互作用，揭示了由细胞质中 ATP 水解驱动的周质酶铜位点的顺序组装线。2022 年 7 月 27 日，德国弗莱堡大学生物物化学研究所所长奥利弗 艾因斯（Oliver Einsle）与美国范 安德尔（Van Andel）研究所首席研究员杜娟合作，在 Nature 发表其最新论文，题为《一氧化二氮还原酶的组装机制中的分子相互作用》（Molecular interplay of an assembly machinery for nitrous oxide reductase ） [ 1 ] 。该工作详细地解析了 N2OR 酶的三维结构和组装机理。▲图 | 相关论文（来源：Nature）p. stutzeri （施氏假单胞，一种革兰氏阴性细菌）在大肠杆菌中被生产为稳定的五亚基复合物 NosDF2Y2，并在膜部分溶解后通过色谱方法分离出来。NosF2Y2 异源四聚体形成了复合物的核心，45kDa 的 NosD 蛋白从其中突出到周质中，成为一个细长的 β 螺旋，与糖类结合的蛋白质以及糖水解酶家族具有结构相似性。NosD 的主轴从与 NosFY 对相关的双轴上倾斜，打破了分子的对称性。在 NosD-NosY 界面，NosD 的 C 端折叠成三个 α - 螺旋（hI-III），部分位于膜内，紧紧楔入 NosY 二聚体。▲图 | 无核苷酸状态下 P.stutzeri NosDFY 的三维结构（来源：Nature）为了描述 NosDFY 的 ATP 结合状态，研究者们产生了一个 NosF（E154Q）变体。在这一变体中，非活性谷氨酰胺取代了催化性谷氨酸残基 154，且该单点变体的 ATP 水解活性降低得十分明显。当在特定的背景下表达时，它会使得 N2OR 酶缺乏活性位点 CuZ 簇，从而导致功能失调。无效的 E154Q 变体使 NosF 处于 ATP 结合状态，正如其他 ABC 蛋白（ATP 结合盒式蛋白，ATP-binding cassette transporter）已经报道的那样。具体来说，ATP 的结合使得 NosF2 二聚体大幅度闭合，这一动作将直接传导到 NosY 二聚体，从而实现关闭跨膜间隙，最终诱导 NosD 在周质中发生复杂的构象变化。这一过程可以用三种主要的旋转模式来描述。▲图 | NosDFY 及铜与 NosD 的结合的构型动力学（来源：Nature）据悉，NosDFYL 在正十二烷基 β -D- 麦芽糖苷（DDM）中会被分离出来，并被重组到糖二醇胶束（GDN）和膜支架蛋白（MSP）纳米盘中，以 3.3- （纳米盘）或 3.04- （GDN 胶束）的分辨率进行冷冻电镜观察。NosL 在复合物中的位置立即变得清楚，其 N 端被解析到 NosL ( C24 ) 的脂质附着点，该位点正好位于膜界面，而脂质附着点本身并没有被解析。这种排列明晰了 NosL 实际上并不像以前提出的那样位于外膜中，而是位于细胞质膜的外叶中。▲图 | 无核苷酸的 NosDFY 接受来自 NosL 的 Cu+（来源：Nature）在三个组成部分的相互作用中，ATP 驱动的 NosD 的旋转运动控制着与其伙伴 NosL 和 N2OR 的相互作用，其具体相互作用模式见下图。负载铜的 NosL 只能在无核苷酸状态下与 NosDFY 结合，在这种状态下，NosD 上的铜结合点朝向膜，允许 Cu+ 从 NosL 转移到 NosD。随后 ATP 与 NosF 的结合引发了 NosD 的旋转，而与膜相连的 NosL 无法跟随，导致其释放。在这种构象中，NosD 现在可以通过相同的界面与 N2OR 相互作用，将其 " 含铜货物 " 转移到该酶的金属位点。然后 NosF 中的 ATP 水解使 NosDFY 回到其无核苷酸的开放构象，而 N2OR 二聚体向膜的移动最终将迫使其释放，并释放出 NosD 上 HMM 三联体的铜结合位点，以装载 NosL 的另一个金属阳离子。在任何一个方向，各自的相互作用伙伴的释放都是通过 NosD 的旋转运动机械地触发的，NosDFY 及其伙伴的复合物的结构十分详细地显示了 ATP 驱动的 NosD 的变形如何使单核伴侣 NosL 的单个铜离子逐步转移，最终组装成四核 CuZ 簇。因此，ABC 运体 NosDFY 作为一个跨膜能量转换器，动态地促进新生酶与 NosD 的铜供体的结合和分离，将一个主要的活性转运蛋白重新利用为 ATP 驱动的杠杆，跨越分隔两个非常不同的细胞区间的边界。▲图 | 铜从 NosL 经 NosDFY 到 N2OR 的运输模型（来源：Nature）总之，该研究以 NosDFY 与 NosL 和 N2OR 酶组成的复合结构为解析对象，这一结构中含有高度复杂的铜位点，利用冷冻电镜，复合结构的组装途径被完全展示。在这一途径中，NosDFY 作充当机械能量转换器的角色，而并不直接起到转运作用。这项工作是科学家首次解析如此复杂的 N2O 还原酶结构，将为微生物 N2O 降解提供完整的理论支撑，并有望推动 N2O 还原降解的技术研究。

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