红外色谱法

近日，中国国家标准化管理委员会公布《2022年第21号中国国家标准公告》，共544项推荐性国家标准和4项国家标准修改单。本次公布的中国国家标准涉及化工、材料、临床检测、化学、化工、环境、植物、食品等各个领域，检测方法涉及滴定法、红外吸收法、等离子体原子发射光谱法、γ能谱分析、辉光放电质谱法、气相色谱法、细胞计数法、透射电镜、二次离子质谱法、离子色谱法等。以下是部分与科学仪器及分析检测相关的标准：　　纺织品 定量化学分析 第4部分：某些蛋白质纤维与某些其他纤维的混合物(次氯酸盐法），　　炭黑 第29部分：溶剂可萃取物的测定，　　锰铁、锰硅合金、氮化锰铁和金属锰 硫含量的测定 红外线吸收法和燃烧中和滴定法，　　饲料中粗纤维的含量测定，　　金精矿化学分析方法 第7部分：铁量的测定，　　金精矿化学分析方法 第8部分：铁量的测定，　　稀土金属及其氧化物中非稀土杂质化学分析方法 第1部分：碳、硫量的测定 高频-红外吸收法，　　表面活性剂 工业烷烃磺酸盐 总烷烃磺酸盐含量的测定，　　锆及锆合金化学分析方法 第26部分：合金及杂质元素的测定 电感耦合等离子体原子发射光谱法，　　环境及生物样品中放射性核素的γ能谱分析方法，　　塑料 差示扫描量热法(DSC) 第5部分: 特征反应曲线温度、时间，　　反应焓和转化率的测定，　　金矿石化学分析方法 第7部分：铁量的测定，　　金矿石化学分析方法 第8部分：硫量的测定，　　皮革和毛皮 化学试验 游离脂肪酸的测定，　　纺织品 非织造布试验方法 第102部分：拉伸弹性的测定，　　稀土铁合金化学分析方法 第1部分：稀土总量的测定，　　稀土铁合金化学分析方法 第2部分：稀土杂质含量的测定 电感耦合等离子体发射光谱法，　　稀土铁合金化学分析方法 第3部分：钙、镁、铝、镍、锰量的测 定 电感耦合等离子体发射光谱法，　　稀土铁合金化学分析方法 第4部分：铁量的测定 重铬酸钾滴定法，　　稀土铁合金化学分析方法 第5部分：氧含量的测定 脉冲-红外吸收法，　　塑料 动态力学性能的测定 第11部分: 玻璃化转变温度，　　金属锗化学分析方法 第3部分:痕量杂质元素的测定 辉光放电质谱法，　　直接还原铁 金属铁含量的测定 溴-甲醇滴定法，　　硫化橡胶或热塑性橡胶 硬度的测定 第7部分：邵氏硬度法测定胶辊的表观硬度，　　硫化橡胶或热塑性橡胶 硬度的测定 第8部分：赵氏硬度（P&J)法测定胶辊的表观硬度，　　塑料 环氧树脂 差示扫描量热法（DSC）测定交联环氧树脂交联度，　　橡胶中镁含量的测定 原子吸收光谱法　　生胶和硫化胶 用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定金属含量　　橡胶 全硫含量的测定 离子色谱法　　颗粒 激光粒度分析仪 技术要求　　色漆和清漆 涂料中水分含量的测定 气相色谱法　　摄影 冲洗废液 氨态氮含量的测定 (微扩散法)　　摄影 冲洗废液 氨态氮总含量的测定 (微扩散凯氏氮法)　　生物技术 细胞计数 第1部分：细胞计数方法通则　　生物技术 核酸靶序列定量方法的性能评价要求 qPCR法和dPCR法　　分子体外诊断检验 冷冻组织检验前过程的规范 第1部分：分离RNA　　分子体外诊断检验 冷冻组织检验前过程的规范 第2部分：分离蛋白质　　农产品中生氰糖苷的测定 液相色谱-串联质谱法　　木薯叶片中黄酮醇的测定 高效液相色谱法　　生橡胶 毛细管气相色谱测定残留单体和其他挥发性低分子量化合物 热脱附（动态顶空）法　　皮革 化学试验 热老化条件下六价铬含量的测定　　皮革 色牢度试验 耐汗渍色牢度　　海洋石油勘探开发钻井泥浆和钻屑中铜、铅、锌、镉、铬的测定 微波消解-电感耦合等离子体质谱法　　纳米技术 多相体系中纳米颗粒粒径测量 透射电镜图像法　　分子体外诊断检验 福尔马林固定及石蜡包埋组织检验前过程的规范 第1部分：分离RNA　　分子体外诊断检验 福尔马林固定及石蜡包埋组织检验前过程的规范 第2部分：分离蛋白质　　分子体外诊断检验 福尔马林固定及石蜡包埋组织检验前过程的规范 第3部分：分离DNA　　纺织品 色牢度试验 耐摩擦色牢度 Gakushin法　　表面活性剂 环氧丙烷聚合型表面活性剂中游离环氧丙烷的测定 气相色谱法　　纳米技术 石墨烯粉体中金属杂质的测定 电感耦合等离子体质谱法　　纳米技术 [60]/[70]富勒烯纯度的测定 高效液相色谱法　　土壤、水系沉积物 碘、溴含量的测定 半熔-电感耦合等离子体质谱法　　铬铒共掺钇钪镓石榴石晶体光学及激光性能测量方法　　金属及其他无机覆盖层 热障涂层耐热循环与热冲击性能测试方法　　金属及其他无机覆盖层 温度梯度下热障涂层热循环试验方法　　锆化合物化学分析方法 钙、铪、钛、钠、铁、铬、镉、锌、锰、铜、镍、铅含量的测定 电感耦合等离子体原子发射光谱法　　氮化铝材料中痕量元素（镁、镓）含量及分布的测定 二次离子质谱法　　硬质合金 总碳量的测定 高频燃烧红外吸收法/热导法　　氮化硅粉体中氟离子和氯离子含量的测定 离子色谱法　　硫化橡胶 热拉伸应力的测定

反相色谱法中有种特殊的模式非水反相色谱法（NARP），色谱柱是非极性（如C18），流动相顾名思义非水全部由有机相组成。非水反相色谱（NARP）中主要用来分离疏水性很强的样品，这些样品的保留能力很强，如脂类、合成聚合物等。非水反相色谱中的流动相是由极性较强的有机溶剂A和极性较弱的有机溶剂B组成。通常A溶剂常用的是乙腈或甲醇，B溶剂是四氢呋喃、异丙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚或者其他极性较弱的有机溶剂。样品保留是通过改变%B或B溶剂的极性来控制的。反相色谱法的保留机制长久以来都是研究重点。溶质分子在固定相的定位可能有几种形式存在，如疏溶剂作用、吸附作用、分配作用等。疏溶剂相互作用假定了溶质分子与配合基对齐并且附着在它上面。吸附意味着溶质分子并没有渗透到固定相里面而是保留在固定相和流动相液体之间。分配作用为固定相和液体类似，溶质分子溶解在里面。见下图：其中疏溶剂的作用是接受比较广的理论：相对而言，疏水性的溶质分子比较喜欢吸附在疏水性的烷基基团上，因此也叫疏水性保留。反相色谱法中键合的烷基等非极性固定相，流动相为水、有机溶剂、缓冲液等极性溶剂。键合相链越长、疏水性越强，溶质的保留值越大；流动相表面张力越大、介电常数越大、极性越强，溶质与键合相的作用越强，流动相的洗脱能力越差，溶质保留值越大。溶质的极性越弱，疏水性越强，保留值越大。对于非水反相色谱法，原理和反相色谱法一致。固定相为非极性固定相。样品由于疏水性较强，保留较大，不采用强极性水溶液作为流动相，全部由有机溶剂组成。非水反相色谱法方法优化同反相色谱法，主要通过改变%B或B溶剂的极性来调节，等度或梯度都能使用，同时柱温对样品的分离也有影响。一般采用shou选采用ACN（A）和THF（B）的混合溶剂为作为初始流动相。若用1OO%THF样品保留仍太强，可以用极性较弱B溶剂（如二氯甲烷或氯仿）来替换，但是应考虑使用二氯甲烷或氯仿的检测波长。非水反相色谱法为反相色谱法的一种特殊模式，色谱柱同反相色谱法常用的非极性色谱柱，流动相全为有机相，样品保留是通过改变极性较弱溶剂的极性来控制；主要分离疏水性很强、不溶于水的样品。在平时工作中，遇到类似物质可以考虑使用非水反相色谱法。

小伙伴们在做日常检测，会发现有些项目，测试标准上使用的流动相中加入了像庚烷磺酸钠、四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵等试剂，这类试剂我们称为离子对试剂，它可以用来改善分离和峰形、缩窄样品的保留范围等。离子对试剂可以看成是在高效液相色谱法中引入了离子色谱方法的一种表现。今天小编和小伙伴们聊聊离子对色谱法的保留基本原理和一些特殊问题。离子对色谱法（IPC）可被看做是以分离离子样品为目标的反相色谱法的改良形式。IPC和RPC唯yi不同的条件是IPC在流动相中添加了离子对试剂R+或R-，这些试剂能在平衡过程中，与酸性化合物的A-或碱性化合物的BH+发生相互作用： 离子化溶质 离子对（酸）A-+R+ ⇔ A-R+（碱）BH++R- ⇔ BH+R- 亲水性溶质 疏水性离子对（在RPC保留较少） （在RPC保留较多）使用IPC可令样品的保留行为产生类似于改变流动相pH的变化，但是IPC能更好地控制酸性溶质或碱性溶质的保留行为，而且无需使用极端的pH（如pH2.5或pH8）。典型的离子对试剂包括烷基磺酸盐R-SO3-(R-)和四烷基铵盐R4N+(R+)，以及强羧酸（通常是离子化的）（四氟乙酸、TFA；七氟丁酸酐、HFBA（R-）），还有所谓的离液剂（BF4-、ClO4-、PF6-）。有关IPC的保留机理目前有两种说法。一种说法是离子对在溶液中形成，然后被保留在色谱柱上，溶质保留平衡过程如下（以离子化的酸性溶质A-和四烷基铵盐R+形成离子对为例）：A-R+（流动相） ⇔ A-R+（固定相）根据这个说法，溶质保留由以下因素决定：① 溶质分子A在流动相中已电离的部分（取决于流动相pH和溶质的pKa）；② IPC试剂的浓度和它形成离子对的趋势；③ 离子对复合物A-R+的k值。另一种说法则认为，IPC试剂先被固定相保留，然后溶质的保留是离子交换的过程，例如，离子化的酸性流动相A-和IPC试剂R+X-：A-（流动相）+ R+X-（固定相） ⇕ A-R+（固定相）+ X-（流动相） 即是，离子对试剂 R+X-先吸附到固定相上，然后样品离子A-代替固定相上的反离子X-。这两种IPC的保留过程都可能在任一个给定的分离中占优势，但是哪一种机制起着更为重要的作用既不容易确定，对实际操作也不重要。在IPC中，可以用于控制选择性的分离条件包括：➩ pH；➩ IPC试剂的类型（磺酸盐、季铵盐、离液剂）；➩ IPC试剂的浓度；➩ 溶剂强度（B%）；➩ 溶剂类型（甲醇、乙腈等）；➩ 温度；➩ 色谱柱类型；➩ 缓冲溶液的类型和浓度。无机试剂（或“离液剂”）如ClO4-、BF4-和PF6-可用于代替常用的烷基磺酸盐作为IPC试剂。无机试剂在固定相上的保留较少，它的保留机理更接近上述的di一种说法，在流动相中形成离子对。离液剂能更好地用于梯度洗脱（有较小的基线噪音和漂移），且当B%较高时也能较好的溶解在流动相中。但是使用离子对试剂也有一些特殊问题，在某些情况下需要严格控制流动相pH；温度控制的重现性必须较高（比RPC更需要），此外，IPC中的某些问题不会在RPC分离中出现或与其他RPC有所不同。还有就是出现伪峰、改变流动相周柱平衡缓慢、有不明原因造成的糟糕的色谱峰型等。首先是伪峰。当把样品溶剂（不含样品）注入到IPC中（即空白实验），我们有时会观察到正峰和负峰同时出现的情况。导致伪峰的原因通常是由流动相和样品溶剂的组成之间存在差异引起的。而使用不纯的IPC试剂、缓冲液或其他的流动相添加剂都会使伪峰的问题更为严重。其次是缓慢的柱平衡。当使用新的流动相时，必须用足够体积的流动相冲洗色谱柱以使色谱柱达到平衡。在IPC中，IPC试剂在色谱柱上的吸附和解吸附在某些情况下非常缓慢，这会造成色谱柱不能被新的流动相完全平衡。所以，无论是旧的流动相还是新的流动相含有IPC试剂时，我们必须确定改变流动相后样品的保留具有重现性（需要以新的流动相进行几小时的冲洗色谱柱才能达到完全平衡）。更换IPC试剂时，先用特殊的洗脱剂把先前吸附在色谱柱上的IPC试剂洗脱下来，再用新的流动相对色谱柱进行平衡。阴离子试剂（如烷基磺酸盐）能用组成为50%~80%甲醇-水的洗脱剂洗脱下来；季铵盐需要使用50%甲醇-缓冲液（如，pH为4~5的100mmol/L的磷酸氢二钾溶液，加入磷酸氢二钾是为了减少季铵基团与固定相上离子化的硅醇基间的相互作用）。任一情况下，首先应使用至少等于20倍柱体积的洗脱剂来冲洗色谱柱，然后再使用新的流动相进行柱平衡。另外，像较弱的离子对缓冲液三氟乙酸（TFA）以及离液剂，不会减缓柱平衡的过程，通常用10~20倍的含TFA或离液剂的流动相冲洗色谱柱足以达到柱平衡。用含IPC试剂的流动相进行色谱柱的初始平衡，则平衡过程可能会非常缓慢。为了避免在开展常规实验的每个新系列之前都要进行12h的平衡，我们建议在完成每个系列的实验后把色谱柱浸泡在流动相（含IPC试剂）里储存。这个权宜的方法使得以IPC做含量测定时能更快的达到柱平衡；假如需要每天或每两天重复一次，我们也建议使用这个办法，然而，当以这种方式储存时，其使用寿命可能会缩短。由于IPC试剂与色谱柱的缓慢的平衡过程，即使用较剧烈的洗脱程序，也不可能把IPC试剂完全从色谱柱上洗脱下来。基于这个原因，我们建议已用IPC分离的色谱柱不要再用于开展不含IPC试剂的RPC分离（TFA和离液剂例外）。假如在IPC中观察到糟糕的峰型和（或）柱塔板数的N值较低时，可以考虑改变柱温。以上就是离子对色谱法的保留原理，和一些特殊问题的解决方法，希望对小伙伴们以后用离子对色谱法能有所帮助。