微生物鉴定

伴随着医学技术的迅猛发展，质谱技术快速走进人们的生活，特别是在医学中的应用越来越广泛，质谱技术在临床中快速鉴定细菌的成果颇为显著。近年来，全国各大检验室大力引进前沿的检测技术，主要针对微生物领域进行精准检测，质谱技术检测具有操作步骤简单、程序自动化和结果准确率高的优点，能够有效对微生物进行鉴定，此外，质谱技术具有高通量、高灵敏度和高特异性，基于此特点，该技术应用在临床微生物检测上，取得了惊人的效果。总而言之，质谱时代已经到来，打破了传统的微生物鉴定局限，为我国的医疗临床事业作出了巨大的贡献。一、质谱技术的应用原理及优势大量实验研究结果显示，质谱技术的工作原理很复杂，主要是对被检测的标本离子质荷比进行详细测定，采用标本与激光辐射基质混合点相结合形成结晶的方式，力争将标本通过基质分子吸附的方式将其电离，形成完全不相同的带电离子。同时，在带电离子的动能加速下，快速形成聚焦，从而进入质谱技术分析仪器科学分析。在微生物的检验中，质谱技术在一定程度上具有明显的优势，其主要优点在于检验时对标本的要求很低，不像传统的检验需要将标本进行分离甚至是提纯，质谱技术可以直接进行点样。与此同时，质谱技术检验微生物的准确性非常高且操作方便快捷。二、质谱技术在鉴定检测中的具体应用（一）细菌鉴定检测质谱技术应用于临床检验时可以对原始的样本进行检测，也可以对已经分离的纯菌落进行检测。实践证明，临床检验标本时采用质谱技术进行检测，其标本可以是原始样本，还可以是通过相关技术已经分离的纯菌落。临床上，质谱技术在对革兰氏阳性、阴性细菌进行检验鉴定时，其检验结果的准备性很高，但是，同样的标本采用原始检验方法进行对比，其结果相差很明显。在用原始方法与质谱检验方法检验革兰氏细菌的结果对比中，质谱技术检验结果明显比原始技术检验结果准确度高，同时采用质谱技术检验获取结果的时间更短，二者检验结果的差值在统计学上具有一定的存在意义。除此之外，质谱技术在细菌鉴定检测中还有一个特殊的优势，即能够将相同或相近的菌株准确区分开，从而快速鉴定出多种细菌的不同类型、各自的属性及种类等，最主要的是其准确率相当高，能够达到90%-95%左右，此外，在细菌鉴定中还有发现新型病原菌的可能。（二）真菌鉴定检测针对于真菌鉴定检验，质谱技术检验结果对比传统技术具有很高的精准率。在二者的真菌鉴定检测结果中，质谱技术检验结果要明显比传统检验方法更准确，且检测时常较短，其检验结果存在较大的差异性，在统计学上具有重要的存在意义。分析结果表明，因为真菌本身很干燥，不轻易挑选菌落，这种情形能够导致靶点涂菌分布不均匀，再加上检验人员如果在涂菌时涂得过薄，最后影响结晶不能完好形成，基于此特点，原始方法鉴定真菌，其鉴定检测结果与真实结果差异是非常大的。（三）药物敏感性检测临床上，质谱技术还可以对药物的敏感性进行检测，其检测结果具有极高的准确率，而且针对于药物敏感性的检测，质谱技术检验结果用时要比传统技术短很多，可以大幅度降低技术人员的劳动成本。质谱技术与传统技术在药物敏感性的检测中，除了在检测时间和检测结果上有很大的差异性外，在检测范围上也有所不同。传统技术检验范围具有一定的局限性，能够检测极少数的细菌，而质谱技术恰恰相反，可检测的范围十分广泛，且具有检测人工成本低和资源节约的作用。三、质谱技术的发展前景临床上，血液感染时一种十分严重且常见的感染性疾病，该疾病经常需要使用抗生素来治疗，但是由于抗生素使用的不规范，加上不间断的侵入性治疗方案陆续实施，导致每年因血液感染的发病机率持续升高，引起了医学界的高度关注。在过去应用传统的方法检验临床数据时，血培养鉴定结果经常需要很长的时间，进而严重影响治疗的最佳时间，因此，质谱技术应用在微生物检验上，解决了以往医疗上的大难题。大量的临床数据研究结果指出，根据目前的医疗科学技术能够把血液中的致病细菌大量提取出来，然后应用质谱技术检验细菌，对比之前的平板培养技术，其结果更加精准且耗时短。专家指出，有相关学者利用常规技术和质谱技术鉴定血培养结果，得出针对于血培养结果的鉴定还是质谱技术更准确、更快速，且具有明显的统计学意义。四、质谱技术存在的缺陷目前，在现代微生物检验技术中，质谱技术有着诸多优势，对比传统的检测技术，最明显的优势就是检验结果精准且用时很短，同时具有操作简单便捷、程序自动化的特点，但是在临床大量的实际检验中，质谱技术还是存在一定的缺陷，值得相关人员去大力研究。临床上，质谱技术是无法精准检验结构较为特殊的微生物菌种，例如罕见的菌种、新出现的菌种、复杂混合的菌种或与图谱极为相似的菌种，在检验结果上存在着一定误差。质谱技术检验细菌出现这种结果的原因是目前已有的数据库并不完善，现有数据库中已有的标准菌株图谱是有限的，质谱技术的数据库还需要持续不断的完善，因此在微生物鉴定的结果中会产生一定的差异，更无法对新型菌种和特殊菌种进行准确鉴定。除此之外，由于质谱技术刚刚在国内兴起，是一项新型高新技术，在微生物鉴定过程中要求技术人员的操作能力比较强，因技术员的相关知识匮乏、器械不充足或检验手法不熟练等因素都有可能对检验结果形成一定的差异，导致结果不准确。同时，质谱技术检验微生物是一种新型的技术方法，检验时需要采购相应的仪器，价格高昂的检验仪器导致市场推广难以进行。近年来，科学技术的高速发展有效推动了我国社会的进步，其中，作为重要的鉴定技术之一，微生物鉴定技术可以帮助医疗人员进一步实现对于病原微生物的合理理解与充分认识，基于此，医疗工作者在临床过程中可以进一步结合相关结果对于患者的健康情况进行全面分析，对于后续治疗方案的合理制定具有良好的促进意义。近年来，在科学技术的引导下，质谱技术在我国临床微生物鉴定工作中展现出了良好的应用价值，从而受到了广大医疗行业从业者的高度关注。总的来看，与传统微生物鉴定技术相比，质谱技术具有良好的应用优势，可以进一步提升微生物鉴定工作的效率与准确性，然而，该技术仍存在一定的发展空间，因此，为了更好地应用该技术为医疗行业服务，相关研究人员仍需结合大量临床实践合理做好对于质谱技术的探索与改良。

仪器信息网讯 2015年6月17日，&ldquo 第四届中国食品与农产品质量安全检测技术国际论坛暨展览会&rdquo 在北京国家会议中心开幕。此次会议特别设置了&ldquo 食品与农产品安全微生物检测&rdquo 、&ldquo 食品与农产品中重金属元素和其他有害物质检测&rdquo 、&ldquo 饮用水安全检测&rdquo 等九个专题。大会第二天，来自北京出入境检验检疫局的曾静博士在&ldquo 食品与农产品安全微生物检测&rdquo 专题中做了题为&ldquo 微生物鉴定技术的发展历程&rdquo 的报告。专题现场北京出入境检验检疫局 曾静博士　　随着人们生活水平的不断提高，食品安全问题越来越受到人们的重视，微生物对食品的污染问题也相应地备受关注。微生物包括细菌、真菌等，有些微生物还是致病菌，对人体的危害很大，因此食品中微生物的检测非常重要。　　在报告中曾静介绍，微生物鉴定技术在检验检疫 食品、化妆品等产品致病菌的检测 动物源性致病菌的检测 植物病原细菌、真菌的检测等工作中起到非常关键的作用。检验检疫工作中的微生物鉴定工作主要有判断该菌是不是目标的致病菌和新发现的菌的种类两项内容。相比而言，后者需要做更完善的实验，参考多种方法相互印证以后才能确定该菌的种类。　　曾静说，目前微生物鉴定技术的发展有两个方向，速度快和分型能力强。速度快的微生物鉴定技术主要以飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定技术为典型代表，可以在数十秒内实现微生物的鉴定 分型能力强的鉴定技术主要包括各种基于DNA的鉴定技术。　　在报告中，曾静介绍，微生物鉴定技术主要有形态学观察、全自动微生物生化鉴定系统和依据细胞物质进行微生物鉴定技术等方法。她在报告中对三种方法进行了详细的阐述。　　据她介绍，微生物的形态学观察主要是依据微生物的形态和生理生化反应等特征来进行微生物的分类和鉴定。用微生物的形态特征来鉴定微生物是由于微生物的形态比较单一，容易分辨 用微生物的生理生化反应特征来鉴定微生物主要是依据微生物细胞壁的组成、微生物发酵产物和微生物对碳源、氮源等养分的利用。　　曾静同时提到这种方法相对比较繁琐、耗时，因此近年来被全自动微生物生化鉴定系统逐步替代。　　她介绍道，全自动微生物生化鉴定系统实际上是将多个生化反应有效整合、浓缩于商业化的板卡上，方便实验室进行微生物的鉴定。全自动微生物生化鉴定系统具有以下优点：1.生化反应数量多，商业化的卡板最多可集合45-46种生化反应 2.实验操作标准化，节省大量人工 3.鉴定速度快，一般3-4小时即可出鉴定结果。基于以上优点，目前，全自动微生物生化鉴定系统已经作为实验室中微生物的日常鉴定手段。除此之外，全自动微生物生化鉴定系统还具有细菌的MIC值测定和耐药表型的检测等作用。　　曾静在介绍依据细胞物质进行微生物鉴定技术时说，该技术主要包括蛋白质的检测和DNA的检测，是目前微生物鉴定技术的两个发展方向。依据蛋白质检测的鉴定技术，具有鉴定速度快的特点，主要检测仪器有飞行时间质谱。基于DNA检测的鉴定技术，对微生物的分型能力很强，该检测技术主要有16S rDNA测序技术、PFGE和全基因组测序技术等。　　在蛋白质检测方面，曾静介绍说，利用飞行时间质谱进行微生物鉴定的原理是通过质谱获得微生物特征蛋白质分子的&ldquo 指纹图谱&rdquo ，然后与大容量的数据库进行对比，最终实现菌落或者菌株水平上的鉴定。质谱鉴定系统的优势主要体现在鉴定速度快，仅需十余秒即可完成。　　在DNA检测技术方面，曾静分别就16S rDNA测序技术、PFGE和全基因组测序技术做了详细的阐述。　　她说道，16S rDNA基因是细菌核糖体DNA的一部分，被称为细菌的&ldquo 活化石&rdquo ，该基因进化速度十分缓慢，具有生物钟的特点，已经作为细菌系统发育的目的基因，16S rDNA序列测定是科研领域细菌分类和鉴定的金标准。目前，常见的商业化测序系统有针对细菌16S rDNA中的500bp保守序列进行测序、针对真菌的28S rDNA的D2基因区域进行测序等。该方法获得的数据有利于致病菌的溯源分析，但是操作过程具有一定的复杂度，耗时较长，另外，基因测序仪和测序耗材试剂的价格较贵，因此不利于在应用层面进行推广。　　报告中，曾静对PFGE阐述道，PFGE(脉冲场凝胶电泳)是一种分离大分子DNA的方法。此种方法的原理是将细菌包埋于琼脂块中，用适当的内切酶在原位对整个细胞染色体进行酶切，酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向的不断交替变换和适合的脉冲时间等条件作用而得到良好分离的方法。PFGE的分型能力极强，可区分菌株水平的差异，目前被全世界各个国家普遍使用。通过PFGE分型可以对细菌性传染病、食源性致病菌进行监测，同时可以进行分子流行病学的调查，但是操作较为繁琐，需要较高的实验技能方可掌握。　　在全基因组测序技术方面，曾静介绍说，该技术可以对菌株进行最为有效的分型，即使是16S差异不大的菌株，也可以通过分布在整个基因组上的单核苷酸多态性位点(SNP)进行区分，是目前分型能力最为强大的技术之一。全基因组测序用于微生物鉴定工作的主要障碍在于使用成本高和专业的数据分析。　　最后，曾静提到，对于检验检疫工作来说，需要根据实际情况选择合适的微生物鉴定方法。同时，为了更快速、更准确的确认病原微生物，可能需要几种鉴定方法联合使用，例如可以先利用质谱鉴定速度快的优势迅速判断致病菌，然后再利用分子生物学的手段进行分型和流行病学的调查。编辑：张葳

近日，国家卫健委对《临床微生物检验基本技术要求》卫生标准征求意见。该征求意见稿规定了临床微生物学（细菌学、真菌学）检验基本技术的要求，适用于开展临床微生物学检验的各级医疗机构及其临床微生物学实验室。小融了解到，征求意见稿中对微生物鉴定技术进行了规范，其中就包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定技术。征求意见稿首先对MALDI-TOF MS技术鉴定微生物给予了肯定，指出MALDI-TOF MS鉴定系统扩展了对常见菌、苛养菌、厌氧菌、丝状真菌以及分枝杆菌、奴卡菌等难鉴定微生物的鉴定谱，目前数据库可鉴定300多个属2000余种菌，远高于自动化、半自动化鉴定系统及手工鉴定方法。然而，并没有一种鉴定方法是完美的，每种方法都有自身的局限性。征求意见稿也指出了MALDI-TOF MS鉴定技术的局限性，即系统数据库的完整程度，包括覆盖的菌种数、每种菌所用的建库菌株数量和来源、以及图谱采集的质量，都会造成鉴定性能的差异，导致对大肠埃希氏菌和志贺氏菌属、沙门氏菌属、肺炎链球菌和缓症链球菌群等等给出错误的鉴定结果。图片来源于：国家卫健委，《临床微生物检验基本技术要求》征求意见稿有这样的局限性，MALDI-TOF MS技术用于微生物鉴定，还香吗？别慌，新一代的MALDI-TOF MS来破局！硬件加持，QuanID微生物质谱更准确融智生物致力于将高端生命科学仪器推向临床实际应用中，研发的新一代宽谱定量飞行时间质谱平台QuanTOF（新一代MALDI-TOF MS），采用了自主知识产权的离子源与探测器电耦合技术，结合更高频率、更高精度的半导体激光解析电离系统及全新设计的混合探测器，实现了MALDI-TOF MS革命性的技术创新。QuanTOF在世界上首次实现在宽质量范围内（10-1000,000Da）保持较高分辨率和灵敏度（中国分析测试协会2019年验证结果，10fmol信噪比大于200，BSA），全扫描范围内的高重现性，使得其可满足定量应用，且定量精度达95%以上，远高于传统MALDI-TOF MS仪器。也就是说，在硬件方面，QuanTOF质谱平台的强大性能决定了以此为依托的QuanID微生物质谱系统鉴定结果的高准确性。QuanTOF新一代宽谱定量飞行时间质谱平台数据库出击，QuanID微生物质谱更强大当然了，对于微生物质谱的鉴定结果起到决定性作用的非数据库莫属。传统微生物质谱系统的建库方法是将收集来的菌株进行筛选，用不同培养基进行培养后，上机采集质谱图，建立微生物数据库。这种建库方法选取蛋白质作为建库依据，容易受细菌培养条件的影响，增加了菌库的不确定性。最准确的细菌鉴定方法是基因测序，然后和Gene bank进行比对鉴定。但这种方法耗时、耗财、耗力。QuanID微生物质谱数据库采用正向建库、反向验证的方法进行数据库的建设。先进行基因组测序，然后翻译成蛋白信息，挑选保守稳定的核糖体蛋白和一些对鉴定有意义的结构蛋白，得到其氨基酸序列，计算氨基酸理论分子量，从而建好数据库；最后用质谱采集标准菌株获得的蛋白谱进行数据库验证。QuanID微生物质谱数据库建库步骤QuanID建库方法考虑了生成蛋白过程中氨基酸的各种修饰（如甲基化、乙酰化等），得到的数据库鉴定结果更准确，而且省去了测序的时间和成本。第三方的验证结果表明，QuanID微生物质谱在种水平和属水平鉴定准确率上均优于国际同类产品。微生物质谱鉴定产品间比较，种水平和属水平准确率统计截止到目前，QuanID微生物质谱数据库可对超过500属、4500余种的微生物进行鉴定（可扩展）；拥有一级、二级两个数据库，独有的二级库可对基因型相近的难分辨微生物（如：大肠杆菌和志贺氏菌等）做出准确鉴定，目前已涵盖100多种相似病原体。另外，融智生物还与国内知名菌种保藏机构合作，不断对中国特有的微生物质谱数据库进行完善。以志贺氏菌为例，同类仪器检出结果均报为大肠埃希氏菌，融智生物QuanID 数据库可以直接鉴定到种水平。QuanID微生物质谱系统给出的志贺氏菌鉴定结果QuanID微生物质谱系统给出的大肠埃希氏菌鉴定结果MALDI-TOF MS微生物鉴定方法已经越来越被广泛接受，这也间接说明了其在微生物鉴定方面的巨大优势。虽然微生物质谱技术有其自身的局限性，但是相信随着质谱技术的进步以及微生物数据库的不断完善，其局限性也会趋于消弥。