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刚接触液相色谱-串联质谱,请问用液相色谱-串联质谱时,为什么要使用两种模式(正离子电喷雾、负离子电喷雾)才能对物质进行定性呢?还有两种模式(正离子电喷雾、负离子电喷雾)的区别是什么时,如SN/T1948-2007甜蜜素的负离子电喷雾,定性、定量的离子对为178。2/79。8;而在正离子电喷雾下,则定性、定量的离子对却为202。2/122。2啊,新手,多谢各位的帮助
近年来,随着质谱技术以及联用接口技术特别是包括电喷雾电离和大气压化学电离在内的大气压电离接口技术的突破,串联质谱及[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]技术在药物及其代谢物的定量和定性研究中发挥了极其重要的作用。对于药物的定量研究而言,常用的质谱为串联四极杆质谱,利用其多级离子选择的特殊性质,在多级离子选择监测扫描方式下,在保证质谱高灵敏度的同时,能极大的提高分析方法的特异性,减少或消除样品中无关物质的干扰,使得痕量分析和鉴定成为可能。并简化了生物样品的制备和分离过程,大大加速样品分析速度,特别适合对分析速度要求较高的药物筛选和临床试验生物样品的测定。在药物及其代谢物的定性研究中,[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]系统中常用的质谱包括串联四极杆、离子阱、四极杆-飞行时间质谱等。这些质谱各有特点,结合同位素标记等技术,在药物代谢产物的分离鉴定、体内代谢途径确定等方面起到了别的分析技术无法替代的作用[1]。由于串联质谱及[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]技术的优越性,目前已广泛应用于药代动力学和药物代谢研究中。本文将重点介绍近年来色谱质谱联用技术在药代动力学和药物代谢研究中的应用。1 串联质谱技术在现代药代动力学研究中的应用1.1 在现代药代动力学研究中的作用 当今新药的研制和开发要求药代动力学研究向高通量和痕量检测的方向发展,串联质谱以其技术上的卓越性能在今天的药代动力学研究中发挥着重要的作用,推动了药代动力学研究的发展。1.1.1 极大提高了分析方法的灵敏度利用LC -MS 法成功建立了Beagle 犬血浆中人参皂苷20(R )-Rh 2的定量方法,并进行了药代动力学研究,结果测得20(R)-Rh 2在Beagle 犬血浆中最低定量限为015ng Πm L ,20(R )-Rh 2在015~200ng Πm L 浓度范围内线性关系良好(r 2=019998)。1.1.2 提高了分析方法的特异性和选择性 传统的分析方法缺点之一在于检测的特异性差,选择性差。通过串联质谱的分子离子和其特征碎片离子的质谱色谱图能分别进行定量,且定量的结果十分可靠。王洪允等以LC -MS ΠMS 同时测定了血浆中奥马曲拉及其中代谢物以及5中同位素内标,共10种化合物[3]1.1.3 实现药代动力学研究的高通量化,提高工作效率 在进行临床药代动力学研究时,经常需要在规定的时间内完成大批量生物样品的制备和分析。由于串联质谱固有的高灵敏度和特异性,能从复杂的生物基质中选择性地测定目标待测物,因此大大简化了样品制备和分离过程。另外,串联质谱对许多新技术表现出的兼容性,使得串联质谱在PK 研究的高通量化上表现出了极大的应用价值。这些技术包括在线固相萃取、柱切换技术和混合功能离子检测技术等。1.2 在药代动力学研究中的定量分析及应用1.2.1[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff] LC [/color][/url]-MS ΠMS 方法建立的基本流程 建立用于体内药物定量分析的LC -MS ΠMS 方法时,首先应该了解药物在生物基质中的特点。人体(或动物)在接受药物后,药物经吸收、分布、代谢(生物转化)、排泄等过程后,在体液中有浓度低,代谢复杂且代谢产物多等特点。因此,建立体内药物的定量方法时,其基本流程为()优化质谱参数建立合适的质谱条件以提高检测的灵敏度和特异性 (2)优化色谱系统建立最优化的色谱系统以实现更有效的分离 (3)优化样品制备方法以从复杂的生物基质中有效提纯药物。1.2.2 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]ΠMS方法在药代动力学研究的应用 王宝莲[4]等采用高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]串联线性离子阱质谱同时检测五味子提取物中四种主要成分,采用电喷雾离子源,多反应监测模式进行检测。结果血浆样品经甲醇沉淀、高速离心后进行分析,各成分在0101~210μgΠm L的浓度范围内线性关系良好,最低定量限为0101~ 0102μgΠm L,建立了专属性强、快速、灵敏、可靠,可满足五味子提取物中四种主要成分药代动力学研究要求的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]ΠMS方法。赵建波等[5]利用高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-质谱检测方法,研究秋水仙碱片的人体药动学。血浆样品011m L,经乙醚-二氯甲烷萃取,以ZOR BAX Ex2 tend-C18为色谱柱,流动相为甲醇-10mm olΠL乙酸铵,流速为111m LΠm in 采用质谱电喷雾离子化法,正离子多重反应检测(MRM)。结果秋水仙碱浓度在0105~10μgΠL范围内线性关系良好 平均回收率分别为(92147±1173)% 日内RS D≤2199%,日间RS D≤2122%,建立了适用于人血浆秋水仙碱浓度的测定及其药代动力学研究的简便、快速、准确可靠的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]方法。杨润涛等[6]建立同时测定大鼠血浆中白藜芦醇苷及其代谢产物白藜芦醇的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱方法。以Lichrospher C18色谱柱为分析柱,乙腈-水为流动相,采用电喷雾离子源(ESI),以多反应监测(MRM)模式检测,内标法定量,用于定量分析的离子反应分别为mΠz389Π227(白藜芦醇苷)和mΠz227Π143 (白藜芦醇)。在选定的样品预处理、色谱及质谱条件下,白藜芦醇苷、白藜芦醇及内标物能够达到基线分离而且离子化效果好。用LCΠMSΠMS法检测大鼠血浆中的白藜芦醇苷及其代谢产物白藜芦醇,线性范围014 ~200μgΠL。2 联质谱技术在药物代谢研究中的应用2.1 确证代谢物结构的基本步骤 药物在体内经过生物转化,形成的多数代谢产物保留了原药分子的基本骨架和部分亚结构,因此,代谢产物与原药可能具有相似的裂解规律,丢失一些相同的中性碎片或产生一些类似的特征离子。用串联质谱对原药和代谢物分别进行目离子扫描、子离子扫描和中性丢失扫描,即可迅速找到可能的代谢产物,并推导出大致结构。常雁等[7]总结了利用MSΠMS鉴定药物代谢物的方法,主要包括以下几个步骤:①测定原药的质谱 ②测定原药的子离子谱,选择质子化分子离子、加合离子和主要的碎片离子进行裂解 ③选择原药的主要中性丢失测定生物样品的中性丢失谱。图谱中的离子即为原药和可能的代谢物的分子离子 ④选择主要的子离子测定生物样品的母离子谱,所得母离子即为各个代谢物 ⑤测定生物样品中所有可能代谢物的子离子谱,解谱得到代谢物的结构 ⑥测定代谢物的子离子谱,选择任一新出现的中性丢失和子离子重复进行步骤3,4。2.2 在药物代谢产物结构确证中的应用 赵宇峰等[8]采用人肠内细菌和乌头碱体外温孵的方法,探讨乌头碱的代谢产物16-O-去甲基去氧乌头碱在人肠内的生物转化。利用离子阱电喷雾串联质谱(ESI MSΠMSn)方法直接分析16-O-去甲基去氧乌头碱的代谢产物。乌头类生物碱在ESI正离子模式条件下形成质子化分子[M+H]+。结果成功检测并鉴定了16-O-去甲基去氧乌头碱被人肠内细菌转化,通过脱乙酰基、脱苯甲酰基、脱甲基、脱羟基以及酯化反应产生新型的单酯型、双酯型和脂类生物碱等10余种代谢产物。马海英等[9]用电喷雾质谱(E SI-MS)法检测观察大鼠肠内菌离体对黄山药总皂苷(TS DP)的代谢及整体给予TS DP后吸收入血成分鉴定。结果显示TS DP容易被大鼠消化道菌群代谢,随着代谢时间的延长,出现了各种甾体皂苷的降解产物及终产物薯蓣皂苷元(D io)。赵宇峰等[10]利用离子阱和傅立叶变换离子回旋共振电喷雾串联质谱方法对牛蒡苷元和人肠内细菌真杆菌体外温孵样品进行测定,探讨牛蒡苷元的生物转化机理。木脂素类化合物在ESI负离子模式条件下形成准分子离子[M-H]-,在真杆菌的作用下,牛蒡苷元经过3次脱甲基反应最终生成4′,4″-二羟基肠内酯。3 展望串联质谱及[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]技术结合了色谱、质谱两者的优点,将色谱的高分离性能和质谱的高鉴别特点相结合,组成了较完美的现代分析技术,近年来在生物医学、药学、环境检测、毒物分析等领域发挥了巨大作用。且随着现代化高新技术的不断发展及[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-质谱联用技术自身的优点,[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-质谱联用技术必将在未来几年不断发展且在药物分析中发挥越来越重要的作用。
电喷雾电离质谱及其在蛋白质化学研究中的应用 桑志红综述 杨松成审校 (国家生物医学分析中心 北京 100850) 摘要 本文综述了电喷雾电离质谱及其在蛋白质化学研究中的应用。由于电喷雾电离质谱可产生多电荷峰,因此大大扩大了检测的分子质量范围,同时灵敏度高,另外它可与HPLC及高效毛细管电泳分离技术联用,扩大了质谱在蛋白质化学研究中的应用。关键词 电喷雾电离;质谱;蛋白质化学 在有机化合物结构的鉴定中,质谱、核磁、红外及紫外等分析手段,从不同的侧面提供了化合物的结构信息。质谱以质量分析为基础,灵敏度高,可提供化合物的分子量、分子式(高分辨质谱)以及一些有关的结构信息。经典的有机质谱要求待测物能气化,有一定纯度,热稳定性好等条件,因此,极性高,不易气化,热不稳定以及不纯的化合物难以用经典质谱测定。近年来随着有机质谱在质谱硬件、软件、电离技术的发展,以及与各种分离方法相联(如色质联用技术)的接口的不断完善,扩大了化合物的检测范围,在分子量测定方面,已从化学小分子扩展到生物大分子,可测定的分子量达到几十万道尔顿。质谱有多种电离方法,包括场解吸、等离子体解吸、激光解吸、快速粒子轰击、热喷雾电离和大气压电离等。每一种电离方法都有一定的分子量检测范围,一般认为热喷雾的分子量检测最大范围约8ku,快原子轰击为25ku。但是随着分子质量的增加,所有分析方法的灵敏度均有所下降。电喷雾电离质谱(ESI-MS)由于可以产生多电荷峰,与传统的质谱相比扩大了检测的分子质量范围,同时提高了灵敏度,使一种M/Z限制在一定范围的四极质谱,就可以分析分子质量超过200ku的蛋白质[1]。另外ESI-MS方法产生一系列的多电荷峰,可以得到准确的分子量,它还可与HPLC和高效毛细管电泳(CE)分离方法相连接,扩大了质谱在生物领域的应用。电喷雾现象的出现可以追溯到两个世纪之前,但真正把电喷雾作为一种电离方法的创新性的研究是由Dole等在大约30前开始的,他们研究的目的是用电喷雾来产生气态大离子。1984年Yamashita等把大气压电喷雾电离技术与四极质谱结合起来,同年,Alexandror把它和磁质谱结合起来。1988年Fenn研究小组报道了用ESI-MS得到了带有45个正电荷分子量为40ku的蛋白质,随后ESI-MS在生物大分子的研究领域进入了一个全新的发展阶段。到目前为止,该法已经能够分析质量范围大约在200ku的蛋白质。1.电喷雾电离过程[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2006/08/200608250906_24655_1237095_3.jpg[/img]附图 电喷雾质谱的电离接口示意图 如附图所示,在毛细管管口加一高电压,作用于经喷雾头进入离子化室的溶液,再将3~6kV的电压加到毛细管和相对的电极之间,电压导致毛细管末端的液滴表面的电荷增强,高电压导致液体表面分裂和多电荷液滴的形成,与毛细管子相对的电极携带的正或负电荷以产生正或负电荷液滴。对于电喷雾的整体而言,带电液滴的形成是整个电喷雾过程的第一步,而接下来的离子化是进行电喷雾分析的关键。而带电液滴形成分子离子的机制还不清楚。Iribane和Thomson提出场辅助离子蒸发假设。在这种模型中,处于液滴表面的离子是由于带电液滴的溶剂在空气中蒸发,当场力在液滴表面达到临界点时由液相直接进入[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]完成离子化的过程。而Rollgen等提出了不同的假设机理,他认为当液滴在大气压下蒸发时,随着溶剂的蒸发,由于液滴直径变小,液滴表面电荷密度增加,当液滴表面电荷达到雷利极限(Raleigh limit),液滴进一步裂变,再次达到雷利极限,再一次“爆炸”,如此循环,当溶剂从小液滴中完全蒸发后形成分子离子。Abbas和Latham的实验证实了从液滴生成分子离子的这一假设。 对于大分子化合物离子化过程的形成可用带电残渣模型理论加以解释,该理论认为大分子[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]离子的形成是基于溶剂蒸发,由库仑爆裂辅助及较小液滴的相互排斥而导致液滴形成仅含有一个分子离子的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]离子,此过程所需能量很低,不会导致分子裂解。但是通过离子源内离子传输区的碰撞诱导解离(CID)电压设置可得到一些有效的碎片离子,但这只对一些不稳定结构有效,并且ESI-MS的CID质谱与电子轰击质谱(EI)及快原子轰击质谱(FAB)有一定的不同,可能是由于前者的开裂环境比EI及FAB源更为复杂,因此在对化合物结构的获得上有一定的制约。随着现代技术的发展,电喷雾与串联质谱(MS-MS)相连,即能为化合物提供很多结构信息。 2.电喷雾电离质谱的分子质量的检测 由于ESI-MS的分子离子状态不是由于裂解(除非在高能量下发生碰撞诱导解离进入真空系统)而得到,因此对于生物大分子的分子量测定变得比较容易。ESI-MS得到的是一簇多电荷的质谱峰群,它的分子质量的测定可从以下假设中得出:(1)两相邻峰相差一个电荷;(2)电荷是由于分子离子质子化形成的。任何两个峰都可有效地测定分子质量。方程式(1),(2)描述了分子质量Mr和多电荷离子(P1,P2)以及它们各自所带电荷(Z1,Z2)之间的关系。P1Z1=Mr+MaZ1=Mr+1.0079Z1 (1) P2Z2=Mr+1.0079Z2 (2)当P2P1时解(1)、(2)方程,得 Z1=J(P2-1.0079)/(P2-P1) (3)通过Z1可得到准确的分子质量。于是可将一簇多电荷峰的质谱图转化成化合物[M+H]+或[M+H]-的质谱图。