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质谱技术是抗体药物分析最重要的技术手段之一。本文简述了抗体药物的发展和质谱技术的原理。对于质谱技术在抗体药物的分析中应用进行了归类整理,主要分为在一级结构和高级结构分析中的应用。抗体类药物是指含有抗体片段的蛋白类药物,所以在恶性肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植排斥等重大疾病上得到了快速的发展,是当前生物药物领域增长最快的一类药物.1.抗体药物发展新趋势在生物药物领域,抗体药物占据着越来越重要的地位,全球销售排名前10位的药物中有6个为抗体药物,抗体药物按来源分类可以分为:鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。目前,批准的单克隆抗体药物中,人源化单抗和全人源单抗数量已占据大多数。1.1 抗体药物偶联物(ADC)抗体药物偶联物(ADC)由单克隆抗体和小分子化合物两部分组成。通过抗体的靶向作用,ADC 的抗体部分和肿瘤细胞表面抗原特异性识别并结合,通过细胞内吞作用,将抗体和小分子化合物一起带进肿瘤细胞内部,释放出小分子化合物。这样既可以降低小分子药物的毒性,同时具有靶向结合的作用。已经上市的两个ADC 是Kadyla 和Adcetris。1.2 双特异性抗体(BsAb)双特异性抗体(BsAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体,能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁,由于基因工程的发展,目前双特异性抗体已经研发出多种类型,主要类型有三功能双特异性抗体、IgG-scFv、三价双特异性分子、串联单链抗体(串联scFv)、DVD-Ig 等多种形式。2.质谱技术近年来质谱仪性能的显著改进主要基于开发出的两种离子化技术:一种是介质辅助的激光解吸/离子化技术。另一种是电喷雾离子化技术。由于这两种电离技术的出现,使原本只能检测小分子的质谱技术,可以运用于检测生物大分子。在过去质谱技术主要运用于对一级结构和序列的表征,而现在质谱技术越来越多地运用于高级结构的分析,而高级结构对于抗体药物的生物活性至关重要。3.质谱技术在抗体药物一级结构分析中的应用3.1 完整抗体药物精确分子量测定当得到抗体药物时,可以直接通过高分辨率的MALDI-TOF或者ESI-MS进行分子量的检测。通过对于脱糖后分子量的检测,可以对于抗体药物进行初步定性分析,并将可以作为药物常规放行的分析方法。对于脱糖前的抗体药物进行分析,可以得到抗体药物的糖基化类型的信息及糖基化水平的分布,对于快速了解生产工艺与药物质量的关系具有十分重要的意义。3.2 药物抗体偶联比(DAR)对于赖氨酸链接的抗体偶联药物,采用C4色谱柱及联用的质谱对去糖基化样品进行分析,根据偶联不同数目药物分子的质量数增加判断偶联数目。对于质谱测定的结果,不仅可以给出确切的药物抗体偶联比值,更能够给出链接不同个小分子药物的分布情况,及反应过程副产物空链接头的分布情况。3.3 肽图谱分析蛋白被特异酶切后的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于不同的抗体药物具有不同的氨基酸序列,蛋白质被酶水解后,产生的肽片段也各不相同,肽混合物的质量数具有唯一特征。可以通过LC-ESI-MS进行肽片段的一级质量数的鉴定,也可以通过LC-ESI-MS/MS对于每个肽片段进行进一步确证,提高肽图谱的准确性。3.4 翻译后修饰研究蛋白质的翻译后修饰(PTM)对于抗体药物的生物学功能十分重要。常见的翻译后修饰有:磷酸化、脱酰胺、甲硫氨酸氧化、糖基化修饰、N端焦谷氨酸环化,C端赖氨酸切除等。质谱分析仪检测蛋白和肽片段的分子量偏差,可以实现高灵敏、高通量和高精确地鉴别蛋白质的翻译后修饰的种类。3.5 N端氨基酸序列检测常规N端氨基酸检测用Edman降解法进行检测,但是抗体药物有时候会出现N 端环化的现象,在这种情况下用Edman降解法需要先对抗体进行去封闭处理,而直接使用质谱可以直接测出N端的氨基酸序列,同时可以检测出N端环化的相对比例。4.质谱技术在抗体药物高级结构分析中的应用4.1 氢/氘交换质谱(HDX-MS)常规的质谱只能获得蛋白的一级结构信息。氢/氘交换质谱(HDX-MS)可以进行蛋白质构象,溶液动力学和表位映射进行分析。在能够调查的蛋白质的高阶结构和动态结构技术中,HDX-MS已经证明适合单克隆抗体和单克隆抗体-抗原复合物的构象分析。4.2 离子淌度质谱法(IM-MS)离子淌度是根据蛋白的电荷和形状选择性分离的方法,可以区分相同分子量的蛋白和肽段,可用于检测蛋白的简单高级结构。4.3 高分辨率傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)高分辨率傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)能够检测最高质量数的质谱仪器,并且有着很高的分辨率。FTICR-MS 是目前被公认为是蛋白质组学研究的有力工具,特别是和完整的蛋白质鉴定和上/下调翻译后修饰(PTM)蛋白质的鉴定。
[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/anti-idiotype-antibody][b]抗独特型抗体[/b][/url]是一种能够特异性结合另一抗体独特位的抗体。独特型由多个抗原决定簇([/font][font=Calibri]Antigenic determinant[/font][font=宋体])组成,每个抗原决定簇都是一个独特位。抗原决定簇或独特位可存在于重链可变区,也可存在于轻链可变区,或者存在于两条链组成的表面。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗独特型抗体在治疗性抗体药物开发过程中有着非常广泛的应用。由于抗独特型抗体与抗药抗体([/font][font=Calibri]Anti-drug antibody, ADA[/font][font=宋体])之间的相似性,抗独特型抗体在免疫原性([/font][font=Calibri]Immunogenicity[/font][font=宋体])分析中可作为阳性对照用于抗药物抗体总量的测定。另外,在抗体药的药代动力学([/font][font=Calibri]PK[/font][font=宋体])和药效学([/font][font=Calibri]PD[/font][font=宋体])分析中,抗独特型抗体可用于检测血液中抗体药物的含量(游离型、结合型和总量)。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]抗独特型抗体的不同应用[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①药代动力学([/font][font=Calibri]PK[/font][font=宋体])分析[/font][/font][font=宋体][font=宋体]药代动力学([/font][font=Calibri]PK[/font][font=宋体])描述并表征了药物在人或动物体内的四个不同阶段:吸收、分布、代谢和排泄(也称为[/font][font=Calibri]ADME[/font][font=宋体])。在药物开发中,[/font][font=Calibri]PK[/font][font=宋体]分析提供了药物与身体相互作用以及疗效强度和疗效持续时间的基本信息。在开发生物仿制药时,需要通过比较[/font][font=Calibri]PK[/font][font=宋体]分析来评价与原研药在生物活性的潜在差异。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]根据结合模式和性质的不同,抗独特型抗体可分为三种类型:抗原阻断型、抗原非阻断型和药物靶标复合物型。基于这些特点,可以建立不同形式的[/font][font=Calibri]PK[/font][font=宋体]检测,以测量血清中的抗体药物含量,包括游离型、结合型或总量。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗独特型抗体可用于定量检测动物或人血清中的抗体药物水平,是[/font][font=Calibri]PK[/font][font=宋体]研究的关键检测试剂。抗体药物定量分析有多种分析方法,其中[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]为最常用的形式。在抗独特型抗体捕获[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]中,将抗独特型抗体包被在平板上,再将含有抗体药物的样本加入系统中,然后用特异性结合药物的标记抗独特型抗体定量抗体药物。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②免疫原性[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]抗药抗体([/font][font=Calibri]ADA[/font][font=宋体])检测[/font][/font][font=宋体][font=宋体]免疫原性评价主要采用抗药抗体([/font][font=Calibri]anti-drug antibody, ADA[/font][font=宋体])分析的方法进行,这是治疗性蛋白药物(如单克隆抗体、[/font][font=Calibri]ADC[/font][font=宋体]和融合蛋白)开发过程中的关键步骤。在这些情况下,通常采用多层次递进式进行(图[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体])。该方法首先采用高灵敏的筛选试验鉴别阳性抗体样本,使用验证性试验尽量减少假阳性结果,然后使用表征试验评估抗体的中和能力。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在整个过程中,抗独特型抗体是必要的试剂。检测[/font][font=Calibri]ADA[/font][font=宋体]的检测方法有多种,包括[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]、放射免疫沉淀法([/font][font=Calibri]RIPA[/font][font=宋体])、表面等离子体共振([/font][font=Calibri]SPR[/font][font=宋体])和电化学发光检测([/font][font=Calibri]ECL[/font][font=宋体])。其中,桥联[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]是最常用方法,可用于检测所有[/font][font=Calibri]ADA[/font][font=宋体]同种型([/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IgM[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IgA[/font][font=宋体]等)。在典型的桥联[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]中,将抗体药物预包被在平板上,并将标记的抗体药物与患者样本一起孵育,以检测是否存在[/font][font=Calibri]ADA[/font][font=宋体](图[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体])。抗独特型抗体将用作阳性对照或参比标准品,用于样本中[/font][font=Calibri]ADA[/font][font=宋体]的定性分析。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/anti-idiotype-antibody-service][b]抗独特型抗体制备[/b][/url][b]套餐[/b][/font][font=宋体][font=宋体]为支持药物开发,义翘神州为客户提供了从抗原制备、抗独特型抗体开发到检测方法建立和试剂盒开发的全方位、一站式的定制抗独特型抗体生产服务。我们拥有丰富的开发经验,包括不同抗体类型如全长[/font][font=Calibri]mAb[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]F(ab')2[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Fab[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]ADC[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]bsAb[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]Fc[/font][font=宋体]融合蛋白等。定制的抗独特型抗体可用于建立药代动力学([/font][font=Calibri]PK[/font][font=宋体])[/font][font=Calibri]/ADA[/font][font=宋体]检测方法,以测定样本中的特异性抗体药物或[/font][font=Calibri]ADA[/font][font=宋体]水平。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]服务:[/font][font=宋体]①抗独特型兔多抗制备服务[/font][font=宋体]交付内容:[/font][font=宋体]? 纯化抗体[/font][font=宋体][font=宋体]? [/font][font=Calibri]CoA[/font][/font][font=宋体][font=宋体]周期:[/font][font=Calibri]2-3[/font][font=宋体]个月[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②抗独特型鼠单抗制备服务[/font][font=宋体]交付内容[/font][font=宋体][font=宋体]? 阳性克隆,[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]管细胞[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]克隆[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 纯化抗体,[/font][font=Calibri]10 mg/[/font][font=宋体]克隆[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? [/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]抗体对(可选)[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? [/font][font=Calibri]CoA[/font][/font][font=宋体][font=宋体]周期:[/font][font=Calibri]4~6[/font][font=宋体]个月[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/anti-idiotype-antibody[/font][/font]
[font=宋体][b]什么是纳米抗体?[/b][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/nanobody][b]纳米抗体[/b][/url]([/font][font=Calibri]nanobody, Nb[/font][font=宋体])是一种人工设计的抗体分子,又称为单域抗体([/font][font=Calibri]single-domain antibodies, sdAbs[/font][font=宋体])、[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]抗体或[/font][font=Calibri]camelid[/font][font=宋体]抗体,是发现于羊驼、单峰驼等驼科以及鲨鱼、鳐鱼等软骨鱼中的一种天然缺失轻链的重链抗体([/font][font=Calibri]heavy-chain antibodies, HCAbs)[/font][font=宋体]。[/font][font=Calibri]1993[/font][font=宋体]年,比利时的科学家在骆驼的血清中发现了一种天然轻链缺失的重链抗体,分子量约[/font][font=Calibri]95 kDa[/font][font=宋体],其中包括两个恒定区([/font][font=Calibri]CH2[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]CH3[/font][font=宋体])、一个铰链区和一个重链可变区([/font][font=Calibri]variable heavy chain domain, VHH[/font][font=宋体]),接着克隆得到只包含一个重链可变区的单域抗体,即[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]抗体。[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]抗体的晶体结构为[/font][font=Calibri]4 nm[/font][font=宋体]×[/font][font=Calibri]2.5 nm[/font][font=宋体]×[/font][font=Calibri]3 nm[/font][font=宋体]的椭圆形,分子量大小仅普通抗体的[/font][font=Calibri]1/10[/font][font=宋体],约[/font][font=Calibri]12-14 kDa[/font][font=宋体],是最小的完整抗原结合片段,因此又被称为纳米抗体。纳米抗体可用于肿瘤等疾病的治疗、疾病的检测、疫苗的研发等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]纳米抗体特性:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1.[/font][font=宋体]高耐热性和稳定性[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将不同的纳米抗体在[/font][font=Calibri]37[/font][font=宋体]℃放置[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]周,结果其抗原结合活性均在[/font][font=Calibri]80%[/font][font=宋体]以上,表明纳米抗体在室温下保存相当稳定,这使其比常规抗体更易于储藏和运输。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]比较了鼠单抗和纳米抗体在高达[/font][font=Calibri]90[/font][font=宋体]℃高温长时间处理的抗原结合活性,发现纳米抗体都保持了较高的活性仍能重新获得抗原结合能力,而所有常规抗体在[/font][font=Calibri]90[/font][font=宋体]℃处理后都丧失了活性,发生了不可逆的聚合。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在恶劣条件,如在高热、离液剂、存在蛋白酶和极度[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值变性的条件下(如胃液和内脏中),正常抗体会失效或分解,而纳米抗体仍具有高度的稳定性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2.[/font][font=宋体]高抗原结合性:[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]纳米抗体独特的结构决定了其高抗原结合特性:纳米抗体较长的[/font][font=Calibri]CDR3[/font][font=宋体],可形成一稳定的暴露的凸环结构(凸环中具有稳定结构的二硫键),能够深入抗原内部以更好的结合抗原从而提高了其抗原特异性和亲和力。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]而传统抗体[/font][font=Calibri]Fab[/font][font=宋体]片段及单链抗体[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]的抗原结合表面常形成凹形拓扑结构[/font][font=Calibri], [/font][font=宋体]通常只能识别位于抗原表面的位点,因此纳米抗体[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]单域具有更加广泛的抗原结合力,甚至当靶蛋白紧密包裹隐藏了普通抗体识别的位点时[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]纳米抗体也可以对其进行表位识别。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3.[/font][font=宋体]较强的组织穿透力:[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]纳米抗体具有强而快的组织穿透能力,可以进入致密的组织如实体瘤发挥作用;并且多余未结合的纳米抗体能够很快的被清除,这相对于单克隆抗体组织穿透力差,不易被清除的不足,更有利于疾病的诊断。另外,纳米抗体能够有效的穿透血脑屏障,这样的特性为脑部给药提供了新方法,有望成为治疗老年痴呆症的新药。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4.[/font][font=宋体]高水溶性、高表达性[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]正常抗体[/font][font=Calibri]VH[/font][font=宋体]结构域单独表达时通常形成包涵体,或者暴露的疏水域相互黏附;而纳米抗体[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]由于其[/font][font=Calibri]FR2[/font][font=宋体]中的疏水残基被亲水残基所取代,使得纳米抗体的水溶性增加,聚合性减少;而且即使以包涵体形式表达,也很容易复性,这样可以大大提高作为药物的利用率。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]因纳米抗体分子量小、结构简单,由单一的基因编码,所以它很容易在微生物中合成,能在噬菌体、酵母等微生物中大量的表达,而且其相对价格低廉、可进行大规模生产,易于普及和应用。有报道,可通过酵母反应器酿造将纳米抗体的产量提高,每公升可达[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]克的产量。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]纳米抗体的应用优势[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①用于生物医药研发(基因工程药物研发、[/font][font=Calibri]ADC[/font][font=宋体]药物研发);[/font][/font][font=宋体]②用于临床体外诊断(胶体金法、酶联免疫吸附法、电化学发光法);[/font][font=宋体]③用于肿瘤研究、免疫学研究等基础研究;申请具有自主知识产权的发明专利及科研奖项;[/font][font=宋体]④拓展研究思路、发表国际知名学术刊物。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]纳米抗体是一种非常有前景的下一代治疗性抗体技术,受到越来越多的研究机构和制药公司的关注。为支持纳米抗体药物的早期发现,义翘神州利用噬菌体抗体库技术自主研发了纳米抗体开发平台,已成功开发了多个纳米抗体候选分子。另外,我们的高通量纳米抗体表达平台,已成功表达和生产了多种纳米抗体形式,包括单价、多价或多特异性[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体],满足客户的各种定制需求。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/nanobody[/font][/font][font=Calibri] [/font]