质谱流式

质谱流式简介 流式细胞术Flow Cytometry是最经典的单细胞分析技术，可以对单细胞中的多个参数进行检测，从而对样品进行亚群和功能分析。基于荧光的流式细胞技术到现在已经发展了50多年，是非常成熟的细胞检测技术，目前被广泛应用于生物学的各个研究领域，是各大三甲医院里进行单细胞检测的金标准，尤其是白血病的检测。传统流式技术使用荧光基团对细胞内的各个蛋白质进行检测，所以又被称为荧光流式。然而，由于荧光基团的限制传统流式技术存在明显的技术瓶颈，一是因为目前可用的荧光基团数量有限，最多一般不超过20个，实验室常用的通常12个；二是各荧光基团的发射谱带较宽，相邻谱带重叠严重，导致一次分析可同时检测的通道数量相当受限。当检测通道数量8个时，实验的panel设计和补偿计算就已经开始变得极其复杂，使得多参数检测成为一项极为费时、复杂的技术性工作，对操作者的要求极高，从而大大限制了它的发展。传统流式的检测窗口非常拥挤，难以容下更多的检测通道 进入21世纪后，新的生物学技术层出不穷，研究人员对于造血发生、免疫细胞分化成熟、癌细胞转化、干细胞自我更新和分化等领域的研究不断深入，单细胞异质性的重要性已经成为共识。要想更清晰地了解细胞内部的多种细胞因子的各种变化，对检测通道数量和信号质量就有了更高的要求。传统流式技术在诸如此类的科研领域中已经力有不逮，迫切需要一种更高效、易用、更多参数同时检测的流式细胞技术。质谱流式Mass Cytometry将传统流式技术和质谱技术进行组合创新，使用镧系元素的各个同位素作为金属标签（或者质量标签）替代先前的荧光标签，并使用ICP-TOFMS对金属同位素进行高速、全谱、高分辨的定量分析，彻底解决了传统流式中存在的荧光串色问题，实现了50个参数的同时检测。质谱流式凭借飞行时间质谱超高的分辨率可以完全分离各个金属同位素，相邻通道间的重叠0.3%，因而无需进行计算补偿，大大简化了实验流程。质谱流式凭借其超高的通量、灵敏度以及稳定性等优点，适用于免疫、肿瘤、血液、药物和遗传学等众多研究领域。概括说来，质谱流式的主要技术特点如下： 通道数量极多。理论上超过100个，目前商业可用50个。随着技术进步，更多元素可以用来作为标签，检测通道数会进一步增加。 临近通道间无干扰，无需计算补偿。ICP质谱具有超高的分辨能力，可以完全区分用来标记的各种元素。实验数据表明，相邻通道间的干扰0.3%，基本可以忽略不计，无需计算补偿。这样不仅使实验流程得到简化，也节约了标本和试剂。使用稀土元素作为标签，背景干扰小，信噪比极高。质谱流式使用生命体中不存在的稀土元素作为检测标签，并利用抗原抗体的特异性结合，可以实现超高的检测信噪比。 超高的灵敏度，保证低丰度蛋白的检测。质谱流式兼具质谱仪和聚合物-金属螯合技术双buff。众所周知，质谱仪无与伦比的灵敏度是其能成为分析仪器之王的主要因素之一。理论上，质谱流式可以检测到万分之一的金属标签原子。除此之外，质谱流式使用在聚合物上螯合了1000个左右的金属元素，再与抗体上的巯基结合，相当于将待测蛋白质进行了3个数量级“扩增”，最低可在单细胞内实现几百个稀有蛋白质的检测。 多样化的数据处理方式，实现对样品的深入分析。通道数激增以及质谱流式超快的检测速度使得数据量急剧增大，对数据处理方法提出了更高的要求。目前，各种降维、聚类和可视化方法已被用于从原始数据中提取有用的生物学信息进行可视化显示，常用的分析方法有：SPADE、PCA、viSNE以及Gemstone等。 质谱流式的工作流程质谱流式的历史1959年，美国化学家Rosalyn Yalow（女）和Solomon Berson在检测血浆胰岛素含量的研究中开发出了放射免疫测定技术（Radioimmunoassay, RIA），因其灵敏度高、特异性强、精确度佳以及样品消耗量小，发展迅速，广泛用于蛋白质、酶、多肽激素以及各种药物的测定。1977年， Yalow和另外两位得奖人共享了诺贝尔生理学或医学奖，获奖理由是“for the development of radioimmunoassays of peptide hormones”。尽管放射免疫测定优点众多，然而放射性同位素对人、环境以及生物样品活性的影响难以忽视。此后，又先后基于酶、化学发光、荧光、金属（尤其是稀土元素）及金属化合物，发展出了胶体金、酶联免疫、时间分辨荧光（基于镧系元素螯合物）和化学发光免疫等各种免疫检测技术。2001年7月17日，MDS Sciex（以后的AB Sciex以及现在的Sciex）的科学家Dmitry Bandura（物理学家）, Vladimir Baranov（化学家）, Scott Tanner(质谱学家)和Zoe Quinn提交了专利，提出了一种使用过渡元素标记抗体，并利用抗体和待测样品的免疫结合，最终通过ICP质谱或ICP发射光谱进行检测的方法，由此开启了质谱流式的纪元。请记住前面这三位大神，后面还会提到。无独有偶，第二天（2001年7月18日）清华大学的张新荣教授提交了题为《A novel combination of immunoreaction and ICP-MS as a hyphenated technique for the determination of thyroid-stimulating hormone (TSH) in human serum》的文章，提出了一种使用稀土元素铕（Europium，Eu）作为标签的免疫反应和ICP-QMS组合的新颖技术，用于血液中促甲状腺激素（TSH）的检测。事实上，2001年3月23号，张新荣教授就提交了另外一篇文章《Application of the Biological Conjugate between Antibody and Colloid Au Nanoparticles as Analyte to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry》，并于次年1月1日发表，文章中提出使用胶体金纳米颗粒作为免疫检测的标签，同样使用ICPMS作为检测器。张新荣教授也是位非常令人尊敬的科学家，做了非常多开创性的研究工作，不盲目跟风，喜欢另辟蹊径。我猜张老师手底下应该没有特别强的工程团队，所以尽管有不少成果转化的项目但是都xxx，纯属我瞎猜乱说，张老师勿怪。国内的质谱公司可以多找张老师聊聊，搞点原创性的科研成果转化。话接上文，更具戏剧性的是，前面提到的专利其实早在2000年12月28日就已通过临时申请的方式进行了提交，并于2001年7月17日提交了正式申请。根据美国的专利制度，为了抢占优先权日可以通过临时申请提交简易的专利文本，但同时需要临时申请后的一年内提交正式申请进行替代，此时正式申请的专利享有临时申请的优先权日，同时临时申请的文本内容也会在正式申请公开时作为优先权文件一并公开。所以理论上来说张新荣教授在质谱流式理论的萌芽期是有重要贡献的，只不过研究院校更追求学术文章，对专利的重视程度远不如商业机构。当然，此时专利也好，文章也罢，和目前我们看到的质谱流式还是有一墙之隔的，还没有提及用于单细胞的检测，不过离成为质谱流式也就是临门一脚的事情。这有一定的历史原因，一方面单细胞检测在当时还不是那么热门，各种免疫检测技术想的都是怎么解决放射免疫检测的弊病；另一方面尽管人们意识到了这个技术对于多参数检测的优势，但是奈何20年前市面上没有几家公司在生产ICP-TOFMS，当然20年后的今天也算不上很多。这并不是因为ICP-TOFMS的技术门槛太高，而是因为ICP-TOFMS几乎没有自己的对口应用，因而缺乏市场驱动。加之由于ICP-QMS（四极杆质谱）引入了碰撞反应池技术（这个技术的发明者还是那位大神Scott Tanner）解决了多原子干扰的问题，很大程度上解决了四极杆分辨率不够的问题，所以定量要求高，分辨率要求不太高的应用使用ICP-QMS就可以很好地满足要求了，性价比比较高。而对于分辨率要求很高的时候，还有各种无机磁质谱，如果是要求有比较高的同位素丰度比，还有多接收的磁质谱。基本上，ICP-TOFMS没有用武之地，当时属于比较小众的质谱仪器。那个时候大概只有澳大利亚的GBC公司和美国的LECO公司在生产ICP-TOFMS，大多时候也是用于地质分析领域。2004年10月，前面提到的三位大神以及同样是在MDS Sciex的同事Olga Ornatsky（生物学家）合伙成立了一家叫DVS Sciences公司，公司名字用的就是三人名字的首字母，不得不说外国人的确很喜欢用自己的名字做公司名，跟我们的那些老字号其实很像。Scott Tanner作为团队的老大任CEO/CTO，从老东家Sciex的手里拿到了相关技术的授权后，2005年他们把公司开在了加拿大，开始打磨这台全新的ICP-TOFMS仪器平台（日后的第一代CyTOF）。Scott Tanner是加拿大人，在多伦多的York University拿到物理化学的博士学位后加入MDS Sciex，并一直那里工作了25年。Scott Tanner认为 University of Toronto是一个非常完美的地方，可以助力他们完成CyTOF仪器和试剂的开发。2005年至2011年期间，Scott Tanner先后任职多伦多大学生物工程系和化学系教授。此后，DVS从Genome Canada和Ontario’s Ministry of Research& Innovation等加拿大政府机构拿到了总计1700万美元的资助。2011年，又从Mohr Davidow Ventures, 5AM Ventures以及Roche，Pfizer等商业机构获得了1500万美元的投资。截止到2011年，DVS从外部获得的资金支持再加上7台CyTOF的销售收入差不多有4000万美元。值得一提的是，在第一代CyTOF定型之前，DVS团队先后经历了3代原型机和8代试剂的开发，可以说是非常的坎坷，技术创业之艰辛可见一斑。2009年，加拿大DVS Sciences公司发布了第一个质谱流式平台CyTOF（Cytometry by Time-of-Flight）。很快，CyTOF的用户就开始遍布世界各处 ，除了加拿大的多伦多大学，还有美国NIH、斯坦福大学、日本、中国台湾等研究机构都有装机。Scott Tanner和第一代质谱流式CyTOF第一代质谱流式CyTOF事实上，质谱流式早期的快速发展离不开一个人，那就是斯坦福大学医学院的Garry Nolan教授，这又是一位全面开花的骨灰级大佬，不仅学术做得好，科研转化还贼成功，是Rigel（NASDQ上市公司）, Nodality（医疗诊断技术开发）, BINA（基因组学计算技术，被Roche收购）, Apprise（测序解决方案，被Roche收购）等公司的创始人，IONpath（另一家单细胞质谱成像技术公司，和质谱流式有比较大的渊源，后面会提到）和Akoya的联合创始人，以及多家公司（包括DVS）的董事和顾问。Garry Nolan教授在免疫学研究领域名声斐然，是传统流式技术的大牛。Scott Tanner带着自己的黑科技找上门后，Garry Nolan教授意识到这是一项至少能改变免疫学研究的革命性技术，随后便基于CyTOF对人类的骨髓细胞进行了研究，在单细胞水平同时进行了34个参数的检测，系统性揭示了造血系统免疫信号的传导机制，对人类造血系统中的细胞分化有了更详细的认识。相关研究成果刊登在Science杂志上，一经发表立刻引发了全球同行的巨大兴趣，至今全世界研究者使用CyTOF发表了不计其数的CNS（Cell、Nature、Science）文章。由此，质谱流式在生物医学领域名声大噪，持续保持一年几十台的装机量，仪器单价也从一开始的60万美元到了80万美元。毕竟，谁都明白掌握核心科技就能快人一步，贵一点怕什么。不得不说，Garry Nolan教授是一个极其合格的KOL，不仅让CyTOF声名远扬，还为CyTOF适配了很多开源的生信算法，制定了各种各样试验流程供后来者参考，同时还建立了CyTOF论文专门解答和讨论用户在使用CyTOF过程中遇到的各种疑难杂症，甚至还组织各细分领域的大佬们专门开设了CyTOF的小型课程（油管上有资源），可以说Garry Nolan教授为质谱流式的普及铺好了第三块基石。2013年5月，DVS推出了第二代质谱流式CyTOF2以及新款MaxPar试剂盒。CyTOF 2采用了全新的底盘设计，能同时检测单细胞中最多达120种生物标记物，每秒最多可检测1000个细胞，改进了离子光学设计从而将灵敏度提高了1倍。5种新款MaxPar试剂盒含有开展高维度实验所需的所有必要试剂，提供最多达17种开箱即用的金属螯合抗体，并且能够与最多16种额外抗体同时结合，在单试管中实现多个细胞群体的高分辨率单细胞检测。第二代质谱流式CyTOF 22014年1月29日，美国公司Fluidigm（富鲁达）宣布将以约2.075亿美元收购DVS Sciences。此时，质谱流式发展到了第二代——CyTOF 2。此后，Fluidigm又从Perkin Elmer公司手里买断了和质谱流式有关的所有专利，自此Fluidigm公司拥有了完整的专利、技术和团队，开始全力以赴推动质谱流式向前发展。不过，CyTOF在富鲁达手里并没有如一开始想象的那般美好，至少时至今日也还没到实现Scott Tanner设想的一年100台的装机量或者是每年1亿美元的销售额。富鲁达目前的市值还不到3亿美元，最近3年质谱流式年均销售收入不到7000万美元（包括仪器、试剂和服务），仪器占比~50%。按平均单价70万美元粗略估算，一年的新增装机大约是50台。这对于一个偏高端的单品质谱仪器其实也还算是一个不错的销量，但对于一个NASDQ的上市公司而言实在算不上是成功，而且科研领域如此火爆，几乎没有同类产品产品的竞争。不得不让人深思，到底是哪里不对劲儿呢？是富鲁达的管理层的问题吗？还是质谱流式的市场有限？亦或是传统流式的反围剿太猛？近些年富鲁达的高层的确频繁换人，今年从Casdin Capital和 Viking Global Investors注入了2.5亿美元的战略融资之后，从丹纳赫等头部生命科学公司引入了大批高管。招商换帅的同时，富鲁达又把公司英文名改了，现在叫Standard BioTools Inc.，这不得不让人联想到我国五行文化中常见的“更名改运”的策略。换了班底，改了名字，又有大笔的现金流进账，且看3年内会不会有什么起色吧。目前质谱流式主要是在科研市场，虽然临床和制药领域已经开展了不少临床试验，但是还没有真正进入临床市场，比较还没有任何一家公司获得任何国家的医疗器械注册证。如果真能打开临床市场的大门，的确是会带来巨大的利润。不过奇怪的是，这么多年过去了一直没有听说富鲁达在进行医疗器械的注册，事出反常不应该啊。至于传统流式的反攻，我相信一定是有的。其实关于质谱流式和传统流式的讨论一直都存在，毋庸置疑质谱流式绝对是有优势的，只不过大部分情况下只是在多参数，高分辨方面有比较大的优势，其他不少指标实际上逊色不少的，比如传统流式的样品分析速度10000个细胞/秒，质谱流式通常低于1000个细胞/秒；传统流式的灵敏度和样品利用效率都高于质谱流式；另外传统流式可以进行细胞筛选和回收，质谱流式则不能。而且，基于荧光的流式技术也在发展，比如2004年提出的光谱流式也是主打多参数，创新点在于光路系统、光电检测和数据算法上，如今2014年成立的Cytek推出的Aurora光谱流式也可以实现5激光40色的多参数检测。而且，其24色的仪器和试剂分别已经拿到了NMPA医疗器械二类和试剂一类注册证，成功迈入了临床市场。2021年7月，Cytek公司成功敲钟NASDQ，市值一度高达25.4亿美元，目前回落到15.8亿美元。2021年，Cytek全年收入1.28亿美元，而今年第一季度净收入同比增长高达44%。所以说，质谱流式的确还是需要居然思危的，赶紧增效降费，找准自己的市场定位，拿下医疗注册证，这些都是当务之急。话说当年在Fluidigm之前，DVS其实是找了多个潜在买家的，包括Life Technologies，Agilent和Thermo Fisher等巨头。大概是当时的DVS过于弱小，而安捷伦和赛默飞这种质谱大厂一看，心想你这个质谱也没什么啊，比你这复杂的我都有，何必花钱买呢。巨头没有看在眼里。如今，Life Technologies已经被赛默飞收购，安捷伦以2.5亿美金买了中国的流式公司艾森生物，而赛默飞也推出了自己的Attune NxT流式细胞仪（基于声波聚焦技术，分析速度高达35000个/秒）。富鲁达历年股票走势图2014年，厦门大学付国教授团队迎来了第一台质谱流式CyTOF-2，这是质谱流式在中国大陆境内的第一次装机。若日后国产质谱流式能有所发展，这应该是一个需要被记住的日子。2015年，富鲁达发布了第三代质谱流式系统Helios，改进了信号放大电路将灵敏度提高了50%，同时采用了更高效的样品进样器将离子云的尺寸减小了50%。第三代质谱流式Helios2017年10月4日，富鲁达发布了一款新的产品Hyperion™ 组织质谱成像系统，同样是使用包含金属同位素标签的抗体试剂对福尔马林固定的样本或者石蜡包埋以及冰冻组织的切片样品进行染色，然后通过激光烧蚀技术进行微米尺度的采样，并最终通过质谱流式进行检测，由此可以实现亚细胞水平的组织成像，为组织微环境的研究提供了全新的视野。质谱流式成像系统Hyperion Imaging System关于质谱流式的“好戏”其实还没完，2019年9月，富鲁达一纸诉状起诉一家叫IONpath的创业公司，称其2018年发布了侵犯其专利技术的MIBITM（Multiplexed Ion Beam Imaging）高维空间蛋白质组学技术，同样可以在亚细胞水平进行40个生物标记物的多重质谱成像。富鲁达称自2019年起IONpath开始向市场积极推广，并顺服和默许富鲁达的用户搭配使用IONpath的MIBI仪器和富鲁达的试剂。IONpath何许人也？还记得我们前面列举过Garry Nolan教授一大堆的创始人头衔吗？没错，Garry Nolan教授是IONpath的联合创始人，而公司的主要创始人也是来自Garry Nolan教授实验室。Garry Nolan教授曾是DVS的科学顾问委员会的主席，DVS被收购之后，仍担任顾问职责直到2016年底。同时，同样来自Garry Nolan实验室的其他IONpath创始人也在富鲁达担任顾问，而且IONpath成立于2014年，是任职顾问不久之后的事情。看来IONpath的确是动了富鲁达的奶酪，据说IONpath的发展速度比DVS早期还要快，第一年的装机量就接近小10台。这恰好给了富鲁达管理层找到了一个业绩不佳的口实，好家伙，原来是你小子在偷偷吸血。作了他！富鲁达来势汹汹，且言之凿凿。其实，老实说从MIBI和Hyperion两者的硬件架构上来看，其实差别还挺大的。尤其是，MIBI的空间分辨率指标其实比Hyperion还高了好多，前者的空间分辨率可到280nm，是真正的亚细胞水平，而后者通常只有1μm。这主要取决于前端的采样技术。我们前面提到Hyperion用的激光烧蚀，那主要受限于激光聚焦的束斑尺寸，目前也基本上只能做到1μm这种水平，而MIBI采用的是二次离子质谱技术（SIMS），这也不是一个新鲜玩意儿，属于一个比较高端的配置，是使用聚焦的高能离子束（Primary Ions，叫它一次离子好了）对样品表面进行轰击，然后解吸和电离出二次待测样品离子（Secondary Ions）的技术。富鲁达的Hyperion Imaging System（黄框和紫框）+HeliosIONpath的MIBI采用了SIMI-TOF技术路线 尽管你装置上有创新，技术路线上有差异，但是富鲁达告IONpath的是方法学侵权，这就无解了。看过刘慈欣《三体》小说的都知道，降维打击吓死人，方法学就是最上位，最简洁的思路，这就是降维打击。不过，任何时候也不能坐以待毙，毕竟天无绝人之路，何况手里还有世界上最领先的质谱成像技术。2020年9月24日，IONpath宣布获得了1800万美元的B轮融资，众多的新老投资人中还包括老牌质谱公司Bruker。自从Bruke推出了timsTOF系列产品之后，在组学领域牢牢站稳了脚跟，现在又在逐步布局空间蛋白质组学了。2021年6月，Bruker还发布了针对单细胞蛋白组学的timsTOF SCP，可在数百个单细胞的分析中得到约 1,500 个蛋白质/细胞的定量分析结果，实现了真实无偏的单细胞蛋白组分析。不得不说，质谱这个已经发展了100多年的玩意儿目前看还是没有尽头的，而国内的质谱水平也还只是小学生，我们的视野应该放开一些，多一些合作开拓大市场，小一些争斗莫纠缠在小市场。话说回来，资本的嗅觉是最敏锐的，钱来了生路就来了。果不其然，2021年1月法院驳回了富鲁达对IONpath的指控，但保留其继续上诉的权利，同时称二者的技术并不完全相同，前者是一个细胞一个细胞的分析，而后者像是打印机一样来回分析，反复扫描。这么说来，专利这种侵权官司远没有几个权利要求读起来那么简单，官司打起来了律师才是最关键的。所以未来如果国内质谱公司遇到和国际巨头打官司的情况，不要气馁和害怕，除了靠好的研发人员夯实技术，也要找个好律师加持。2021年5月富鲁达发布了第四代质谱流式CyTOF XT，更加注重整机自动化运行，新增了样品自动上样、采集功能，配备了内部监控系统，自动感知管路堵塞，自动调谐，自动数据转换，一管样品可以实现50+标志物的多参数分析。第四代质谱流式CyTOF XT2022年5月11日，IONpath宣布完成了Corporate Round融资，巨头Thermo Fisher是唯一投资结构，同时这也是IONpath的第4次融资。被第二个质谱巨头加持，说明IONpath的路是走对了，这下妥了。而就上个月，2022年6月10号，Thermo刚宣布了已与TransMIT质谱开发中心合作，共同促进质谱成像技术在空间多组学领域的发展，具体是将前者的Orbitrap质谱和后者的Scanning Microscope Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization(SMALDI) MSI和3D-surface MSI技术进行联用，可用于绘制包括代谢物、多肽、酶解的蛋白质等多种标记物分子的空间分布。由此可以看出，质谱成像技术是巨头们都在积极布局的一个市场。所以不管是Standard BioTools还是IONpath，日后无论能不能经营好，技术肯定是不愁找不到好买家的。国外热热闹闹的同时，国内也是暗流涌动，毕竟现在生物技术、医疗、质谱都是好生意。2021年9月，聚光科技子公司谱育科技同时发布了质谱流式细胞仪和全光谱流式细胞仪。2021年10月，宸安生物发布了质谱流式Straion星瀚。事实上，国内还有不少厂家在路上，至少一只手数不过来。EXPEC 7910 ICP-QTOF（from谱育科技官网）Starion星瀚 （from宸安生物官网） 质谱流式的确是个不错的方向，没有那么多的巨头挡着，技术路径比较简单，市场前景又很明朗，还能彰显大国重器，为国分忧，是再好不过的潜力股了。在笔者看来，质谱流式技术的发展才刚刚开始，技术的迭代、细分和升级依然大有可为。未来的领先地位或许不会是Standard BioTools掌握，至少从目前的趋势看不会。国产质谱的崛起需要有一款旗帜产品在全球树立国产质谱的形象，质谱流式目前就具备这样的特质。参考资料：[1]Palladium-based Mass-Tag Cell Barcoding with a Doublet Filtering Scheme and Single Cell Deconvolution AlgorithmDOI: 10.1038/nprot.2015.020.[2]Meeting the Challenges of High-Dimensional Single-Cell Data Analysis in Immunologyhttps://doi.org/10.3389/fimmu.2019.01515[3]单细胞蛋白组学之质谱流式细胞技术https://phoenix.tsinghua.edu.cn/index.php?c=show&id=19[4]Progress and Applications of Mass Cytometry in Sketching Immune LandscapesDOI 10.1002/ctm2.206[5]The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1977https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/1977/summary/[6]Standard Biotools财报https://investors.fluidigm.com/static-files/5ac228c4-b83b-4027-affc-5d8a9b65febb[7]多伦多大学杂志访谈：Seeing Into the “Soul” of Cellshttps://magazine.utoronto.ca/research-ideas/science/scott-tanner-cell-analysis-cytof-mass-cytometry/[8]Standard BioTools官网https://www.fluidigm.com/[9]中国第一台CyTOF 2质谱流式细胞仪震撼亮相厦门大学https://www.bio-equip.com/news.asp?ID=453068556[10]C&EN专访：Instrumental Efforts——Entrepreneurs take big risks to bring the latest scientific tools to markethttps://cen.acs.org/articles/89/i32/Instrumental-Efforts.html[11]Garry Nolan’s Labhttps://web.stanford.edu/group/nolan/index.html[12]MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structureDOI: 10.1126/sciadv.aax5851

随着生命科学的不断发展及对单细胞分析手段越来越高的需求，传统的荧光流式细胞技术已不能满足科学家们的需要。质谱流式技术(Mass Cytometry)因此应运而生。它通过对传统流式技术和质谱技术的整合，是目前单细胞多参数分析中最先进的技术之一，也有越来越多国内的科研、临床及药物研发的工作者们将他们敏锐的目光投向了这一先进的技术，研究方向涉及肿瘤、免疫、转化医学、干细胞、药理研究等诸多领域。尤其是2020年新冠疫情爆发，质谱流式细胞技术在这一领域更是提供了良好的支持。这里是2020年质谱流式平台部分令人印象深刻的文章。　　图1 质谱流式常见的实验流程　　新冠肺炎研究　　2020年的新冠疫情可以说是年度最大的黑天鹅，给全世界的各个行业都带来了巨大的冲击。而科学工作者和医务工作者们也为了应对这一突发状况做出了巨大努力。在研究过程中，研究人员逐渐发现轻度、中度和重度患者的免疫系统存在显著差异。在这方面，北京佑安医院是比较早的展开研究的单位之一。张玉林等人使用质谱流式成像技术，分析了两位新冠患者肺组织切片的免疫细胞组成。该结果证明，肺组织有CD4 T细胞、CD8 T细胞、NK细胞和巨噬细胞浸润，并且CD45RA T细胞异常是新冠肺炎的特征之一。随后，欧阳雅博和王文敬(图2)等人分别发表文章，分析了不同病程病人的基因表达水平和T细胞占比。测序结果显示，重症病人的T细胞数量下降，其激活和分化的基因表达水平下调。通过质谱流式分析PBMC样本，不同病程的患者的免疫细胞组成同样差异巨大。紧接着，时红波等人又在单细胞蛋白和细胞因子两个层面分析了新的病例，除了进一步验证了上述细胞亚群比例下降之外，还发现IL-2等细胞因子的浓度降低。而且，免疫细胞比例和细胞因子浓度均可用于预测患者病情的恶化程度。这些研究为我们了解新冠肺炎的进展和诊断提供了巨大支持。　　图2 质谱流式分析不同病程病人的PBMC中免疫细胞占比情况。Wang et al.　　加利福尼亚大学的Neidleman等人使用含38个靶点的质谱流式panel分析了9名新冠治愈者的样本，证明了恢复期患者的T细胞特异性激活，其中的CD4 T细胞和CD8 T细胞分别主要由Tcm和Temra细胞组成。这些细胞表达CD127(IL-7受体)，可以稳定增殖，并且持续2个月以上。德国的Schulte-Schrepping等人则联合应用单细胞转录组和质谱流式，在转录组和蛋白水平分别分析了100例临床样本，该研究的内容倾向于髓系细胞。结果显示重度患者的骨髓紧急生成，表现为免疫抑制的前中性粒细胞、幼稚中性粒细胞、功能障碍的成熟中性粒细胞和抑制性HLA-DRto单核细胞大量出现。路易斯维尔大学的Morrissey等人同样重点研究了髓系细胞，其方向则是中性粒细胞对于炎症和病程中出现的凝血问题。结果显示重症患者样本中存在低密度炎症中性粒细胞亚群，并在临床上与D-二聚体和全身性IL-6和TNF-α水平相关，可导致新冠相关的血栓等凝血疾病的出现。　　免疫响应图谱与疾病治疗　　对疾病本身的分析固然重要，但是当务之急是疾病治疗。合理的治疗方案则离不开对患者的免疫系统的持续检测，这里包括了体液免疫和细胞免疫两个部分(图3) 。　　图3 影响免疫反应的各种细胞类型　　Rodriguez等人在治疗过程中，纵向监测了39名新冠患者的免疫反应，绘制了康复过程中的免疫轨迹。结果发现，IFNγ-嗜酸性粒细胞在肺部过度炎症反应之前激活，并随着病情改变了细胞的凝集作用。苏黎世大学的Chevrier等人利用质谱流式和血清蛋白质组学，分析了患者们的先天免疫状态。CD169+ 单核细胞迅速扩增，全身性CCL3和CCL4水平升高等等的一系列数据，支持了病理性先天免疫可能是新冠感染的关键机制，以及重度新冠肺炎需要抗炎干预措施。这一结果揭示了炎症反应在新冠肺炎中的作用，进而出现了一些与之相关的研究。苏黎世大学医院的Adamo等人继续了CD8 T细胞和相关炎症的研究。通过分析发现，不论是绝对数量还是相对数量，外周血CD8 T细胞均下降明显，而且T细胞凋亡和向炎症组织迁移是外周血T细胞减少的原因。并且，IL-7(一种T细胞的生长因子)水平升高，这一结果表明了患者全身T细胞减少和T细胞增殖增加的迹象。质谱流式结果的拟时分析同样显示，重度新冠患者存在广泛的T细胞减少现象，以及随后的T细胞增殖增加的特征。这些结果表明，CD8 T细胞减少可能是重度新冠的标志，并进一步定义了破坏性的炎症环境，以及临床应针对性的及时抗炎，以提高治疗效果。斯坦福大学的Arunachalam等人报告了一种系统生物学方法，用于评估轻至重度疾病的新冠患者的免疫状况。该团队使用用于蛋白质磷酸化特异性表位的胞内标志物的质谱流式磷酸蛋白panel，对PBMC中的免疫细胞表型进行了分型。结果发现，在患者的PBMC中，骨髓细胞HLA-DR和促炎细胞因子表达降低，浆细胞样DCs mTOR信号和IFN-α的产生受损。相反，血浆中炎症介质(包括EN-RAGE、TNFSF14和抑癌蛋白M)的水平升高，这与疾病的严重程度和人血浆中细菌含量的增加有关。最值得注意的是，在所有感染的个体中，成浆细胞和效应CD8+ T细胞的频率增加，并且CD8+效应T细胞的反应时间延长。在新冠肺炎的治疗方面，质谱流式同样起到了重要的作用。冷子宽等人利用间充质干细胞对新冠患者进行治疗，并逆转了重症病人的细胞因子风暴。利用质谱流式检测，可以看到治疗后的患者免疫细胞组成恢复正常。　　疫苗开发　　根据前期的对于新冠病情的分析不难看出，CD8 T细胞对于消除和保护病毒感染至关重要。Schulien等人利用MHC-I四聚体分析定义了新冠肺炎康复期患者的特异性CD8 T细胞的抗原表位，设计利用抗原多肽刺激T细胞，使其被激活为新冠病毒特异性T细胞。新激活的T细胞与原有的T细胞的功能类似，可以对患者起到保护作用。加州大学旧金山分校的Neidleman等人则利用质谱流式确定了疫苗的潜在目标。他们利用定制的离体模型，使用38个标记的抗体panel定义了康复期新冠患者的SARS-CoV-2特异性T细胞表型。该研究确定了针对SARS-CoV-2的有效免疫力的共同特征，并建议诱导类似的针对该病毒的长寿命CD4+和CD8+ T细胞应答作为疫苗接种策略，并评估疫苗诱导的SARS-CoV-2特异性T细胞应答的特征。弗吉尼亚梅森医学中心的DeGottardi等人利用质谱流式研究了黄热病病毒的疫苗。他们分析了cCXCR5 T细胞的起源和发育(cCXCR5可用作TFH细胞活性的生物标志物)。利用这一方法来评估疫苗的安全性。通过对比疫苗接种前后病毒特异性T细胞的活化情况，证明了该疫苗仅引起了病毒特异性T细胞数量的增加，其他类型的细胞不受影响，进而证明了疫苗的安全性。法国疫苗研究所的Palgen等人，利用质谱流式评估了疫苗的接种时间间隔与免疫保护之间的关系。他们利用35个标记的抗体panel，分析了安卡拉病毒疫苗的短期和长期接种方案所产生的影响。间隔2周进行两次皮下注射会导致免疫反应的二级反应减弱和类似的先天髓系反应。相反，间隔2个月可以改善抗体反应的质量，并涉及更多的活化成熟先天细胞。文章揭示了中性粒细胞的新特征，并发现了相关的嗜酸性粒细胞在疫苗响应中的作用，从而确定了初次免疫-加强接种过程中先天性和适应性免疫的机制。在疫苗上市后的安全评价上，质谱流式同样发挥着作用。2009年流感大流行，有证据表明接种疫苗导致了1型嗜睡症(NT1)的发病。隆德大学的Lind等人利用质谱流式分析了GSK公司的Pandemrix导致的NT1患者的免疫学特征。结果显示，受影响患者中特异性T细胞亚群明显减少。这项研究标志着使用单细胞分析来解释疾病发病机理和免疫过程的新方法的可能性，并证实了进一步研究CD8+ T细胞以用于未来潜在疗法的观察。马萨诸塞州的Reeves等人，针对寇热(Q-fever，一种由贝纳立克次体(Cb)引起的类流感疾病)，在小鼠模型上展开了研究。研究人员利用质谱流式平台，使用200μL的样本分析了疫苗接种后，循环免疫细胞群的变化(图4)，证明疫苗接种10天内即起到了保护作用，并至少持续到了接种后35天。这项研究完善了对Cb疫苗接种的综合免疫反应的理解，确定了关键免疫调节蛋白的新作用，并为评估Cb候选疫苗提供了信息，同时使反应原性降至最低。　　图4 评估接种Cb疫苗后关键标志物的表达 Reeves et al.　　肿瘤研究与治疗　　免疫疗法是目前癌症疫苗和治疗最引人注目的领域之一，而质谱流式具有识别新抗原特异性T细胞的独特能力，因而在区分疫苗特异性激活的免疫细胞方面脱颖而出。加利福尼亚大学旧金山分校的Mueller等人报告的一项针对弥散性中线神经胶质瘤(DMG，一种致命的小儿脑癌)的临床研究中，研究人员评估了含有特定H3突变的DMG患者中，针对该突变的疫苗的安全性、免疫反应性和有效性。该疫苗每三个月进行一次免疫监测和成像，并使用质谱流式评估PBMC中的免疫反应。该小组利用MHC Dextramer(图5)和质谱流式技术来分析多个免疫亚群，以更好地探索疫苗触发的抗原反应性CD8+ T细胞与延长的中位OS之间的关联。结果发现，H3反应性CD8+T细胞扩增的患者的中位OS为16.1个月，而相应患者的中位OS为9.8个月。该疫苗的接种耐受性良好。与无应答者相比，H3特异性CD8+免疫应答的患者OS延长。而实验本身则证明了对于细胞表面，细胞质，细胞核等免疫监测的重要性。这项研究验证了质谱流式技术对基于CD8+ T细胞的免疫疗法进行高维免疫监测的能力。　　弗雷德哈钦森癌症研究中心的Li等人通过CyTOF技术结合MHC四聚体来研究免疫检查点治疗的小鼠模型，以便更多地了解免疫检查点抑制剂如何影响肿瘤特异性T细胞，以及这些细胞为何未能成功攻击肿瘤细胞。研究人员发现，活化的肿瘤特异性CD8 +肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在免疫治疗后大量扩增，但是并未导致肿瘤消退。结合单细胞转录组测序的结果，TIL扩增与表型变化相关，包括耗竭marker富集、CD39表达和靶向肿瘤细胞的TCR激活等等。这项工作为研究肿瘤中的新抗原提供了一个新模型，并重新探讨了新抗原特异性T细胞在免疫治疗中的作用。　　图5 金属标记的MHC四聚体示意图，用于鉴定抗原特异性T细胞　　由于篇幅有限，这里仅仅列举了部分研究领域相关的论文，但是令人印象深刻的论文远不止我们所提到的这些。质谱流式可以在单个样本的单细胞水平检测大量(≧50个)不同的蛋白靶标，从而使其能够高效、快速、可靠地获得全面的免疫图像。指示疾病的进展或改善情况。

p　　科研人员经常面临一个困境，如何同时达到如下目标：(1)在广泛的网络中获取特定细胞行为尽可能多的信息；(2)采取高针对性的方法，对有限数量的细胞特征进行分析，获得更高的分辨率。目前的流式细胞分析技术和质谱分析技术单独都很难达到以上目标。/pp　　如果你有同样的困惑，那先恭喜你，看完下面内容，从此不再纠结。/pp　　◆◆strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "质谱流式档案/span/strong◆◆/pp　　学名： 质谱流式/pp　　洋名：Mass Cytometry/pp　　昵称：CyTOF/pp　　自述：相对于其他研究细胞的技术，我算是比较「young」的了，也许你不认识我，但是我爹「质谱技术」、我娘「流式技术」的大名应该如雷贯耳吧?作为他们的优秀结晶， 我是地道的「富二代」，综合了我娘的「单细胞水平研究能力」和我爹的「多指标分辨能力」，正所谓「青出于蓝而胜于蓝」，轻松实现单细胞水平一次检测四十多个蛋白标志物，让你对细胞的研究更具有深度和广度。下图 show 一下我是如何实现如此强大的功能：/pp　　img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/5a2c7bab-bff0-4a6f-bc19-713ecce8c367.jpg" title="11.jpg" alt="11.jpg" style="text-align: center "//pp　　采用金属元素标记的抗体来识别细胞表面或内部的抗原，细胞被逐个送入等离子炬中进行离子化，使得标签金属离子释放出来，释放出的金属离子被送入飞行时间检测室中进行分离检测，检测器会精确记录各种离子到达的时间，进而换算出每个细胞中各种金属标签的精确含量。最后，可采用 SPADE、PCA、viSNE 以及 Gemstone 等方法分析数据。/pp style="text-indent: 2em "为啥要研究单细胞水平呢? 因为细胞具有异质性。如同下图，玻璃珠大小均一，似乎都一样。但是一旦赋予色彩，立刻表现出个性化。我们的免疫细胞、干细胞、肿瘤细胞等均具有异质性，通常不能用单一的标志物来区分它们，需要多个标志物同时使用才能将细胞更精细的分群和研究。传统的荧光标记流式细胞分析技术，在各个荧光通道之间通常会有信号的叠加，出现干扰，导致结果不准确。但使用各种金属元素作为标签的质谱流式技术(CyTOF)可以同时检测四十几个蛋白标志物，且无需考虑通道之间的干扰。/pp　　img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/408fd1b0-90ef-402f-8dd9-5f77bab61ea0.jpg" title="111.jpg" alt="111.jpg" style="text-align: center "//pp　　以人外周血白细胞分型为例， 流式细胞术同时标记十色以上分析难度较大，我们一起欣赏下质谱流式标记 27 个蛋白标志物的结果：br//pp　　img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/b6fc56fe-5352-4e1c-a2a7-3d793a0e02be.jpg" title="14.jpg" alt="14.jpg" style="text-align: center "//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "27 种抗体染色白细胞，并通过质谱流式技术分析/span/pp style="text-indent: 2em "◆◆strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "质谱流式应用实例/span/strong◆◆/pp　　strong粒细胞的发育和功能研究/strong/pp　　Evrar 等人利用质谱流式(CyTOF)技术，同时检测 40 个表面标志物的表达情况，对小鼠骨髓样本进行了系统的亚群分析，并细致研究了粒细胞分化过程中细胞的表型和功能变化。作者在骨髓中发现了三种不同的中性粒细胞亚群：具有高度增殖活性的前体细胞 preNeu 亚群，未成熟亚群和成熟亚群, 后两者均由 Pre-Neu 定向分化而来。这三种亚群在粒细胞分化过程中占有非常重要的地位。深入研究表明，C/EBPε 转录因子在巨噬细胞祖细胞分化为 preNeu 的过程中起到重要作用，随着 preNeu 的继续分化，细胞增殖的活性会降低，相反细胞迁移及免疫功能则会逐渐增强。作者利用胰腺癌小鼠模型进行了验证，结果表明，相比肿瘤负荷低的小鼠，肿瘤负荷高的小鼠外周血及肿瘤组织中未成熟中性粒细胞浸润的比例更高一些，而成熟中性粒细胞的比例并没有显著差异。/pp　　img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/c4d8a3ef-ab09-4d07-8926-e8e771cde005.jpg" title="15.jpg" alt="15.jpg" style="text-align: center "//ppbr//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "质谱流式结果揭示了具有不同表型特征的增殖性中性粒细胞/span/pp　　strong细胞因子检测/strong/pp　　Baxter等同时标记了 26 个表面标志物和 14 种胞浆细胞因子，通过不同标志物组合分群并研究不同刺激条件下多种细胞因子的表达，以阐明自身免疫疾病中细胞因子表达水平的改变是如何导致自我耐受受损。　　/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/d3fe1793-81ce-435b-94fe-64ec4bbf2350.jpg" title="16.jpg" alt="16.jpg"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "SLE 疾病患者的 CD14hi 单核细胞中诱导的细胞因子/span/pp　　strong信号通路研究/strong/pp　　Treg 细胞和辅助 Th17 细胞分化不平衡会导致自身免疫疾病或炎症反应的发生。厦门大学周大旺教授团队[5] 应用 CyTOF 质谱流式细胞仪发现了 Hippo 信号通路中转录共激活因子 TAZ 在决定 CD4+ 初始 T 细胞分化为炎症的 Th17 效应细胞并抑制 Treg 调节性细胞分化中发挥着关键作用。深入研究发现，诱导 Th17 细胞分化的两大信号 IL-6 和 TGF-b 下游的转录因子 Smad3 和 STAT3 协同促进 TAZ 基因的转录和表达。TAZ 通过组蛋白乙酰化转移酶 Tip60 降低 Treg 细胞中关键蛋白 Foxp3 乙酰化水平来抑制 Treg 细胞的分化。当缺失 TAZ 或过表达 TEAD1 后，可以大幅提高初始 T 细胞分化为 Treg 细胞的能力。/pp　　这项研究阐明了 TAZ 在调节 CD4+ 初始 T 细胞分化为 Th17 细胞和 Treg 细胞的过程中发挥着关键调控作用及其重要机理。该项研究对多种自身免疫性疾病的发病机理提供理论依据，也为早期诊断和治疗慢性炎症性疾病提供可能的分子标志物和治疗靶标。/pp　　img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/b89e5f88-b84a-4cc5-b97f-cde8ef396e94.jpg" title="17.jpg" alt="17.jpg" style="text-align: center "//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "Th17 亚组显示出 TAZ 的富集，TAZ 与 Th17 细胞介导的自身免疫疾病相关/span/pp　　当然，金属标记可以实现无交叉的多重标记，但是如果抗体种类不能满足需求也是极为尴尬的，Bio-Techne 旗下两大抗体品牌 R& D System® 和 Novus Biologicals® 提供3000+ 种用于质谱流式技术的抗体，满足多种金属标记的需求。/p