化学发光检测

吉林检验检疫局建立的金标法检测单核细胞增生性李斯特氏菌技术作为当今检测病原体和诊断疾病方面最为敏感的免疫学技术之一，不仅操作简便、快速、特异，更为重要的是适用于广大基层食品监管部门的现场检测和诊断，这些特点都是其他免疫学方法所无法比拟的。　　该技术不仅具有巨大的发展潜力，而且还具有广阔的市场和应用前景，如可适用于医疗卫生行业，出入境食品口岸抽查和鉴定、流通领域卫生监督和工商行政部门和质监部门的食品企业监管等，甚至可以走进餐馆、家庭进行简易的食品自控和检测等。　　由吉林出入境检验检疫局承担的国家质检总局科研课题《应用化学发光探针及免疫金标法检测食品中多种致病菌的研究》在2011年获得了国家质检总局“科技兴检”三等奖。该课题建立的化学发光探针检测技术能够快速检测食品中常见的四种病原菌：空肠弯曲菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、大肠杆菌O157和金黄色葡萄球菌。其中对单核细胞增生性李斯特氏菌还建立了应用免疫胶体金试纸条的快速检测方法。　　急需速测技术　　我国的食品生产加工企业数量多，规模小，较分散，而且为数较多企业过分追求利润法律意识淡薄，社会责任心不强导致其产品质量良莠不齐。　　据报道，我国45万个食品生产企业中，员工人数10人以下的食品生产加工小作坊就有35万家，约占80%，因而导致食品安全事故时有发生，给社会和消费者的健康造成了巨大危害。　　而目前的食品卫生监管的检测手段主要依据国家标准或行业标准规定方法进行，虽然这些方法准确可靠，但这些方法一般都需要建设专门的微生物检测实验室，配备专业的检测技术人员，需要较长的检测周期，由此造成的检测成本过高，缺乏时效性等问题，使一些突发的食品安全事件不能迅速得以解决。因此发展和建立一种快速、简便、灵敏准确的检测技术，作为标准检测方法的初筛技术，是解决上述问题的有效手段之一。　　食品检验新兵　　化学发光探针技术的原理是互补的核酸单链会特异性识别并结合成稳定的双链复合物。这一检测系统利用一个标记有化学发光物的单链DNA探针，可以特异性的识别和结合目标微生物的核糖体RNA。微生物中的核糖体RNA释放出来后，化学发光标记的DNA探针就与之结合形成稳定的DNA-RNA杂合体。标记的DNA-RNA杂合体会与非杂交探针分离，并在化学发光检测仪中进行测量。样本的检测结果通过计算与阴性对照进行比较得出结果。利用化学发光剂标记和检测核酸使得许多非放射性标记检测的灵敏度达到甚至超过了同位素标记测定。　　在众多的化学发光体系中，应用最多的化学发光体主要有三类：增强鲁米诺发光体系、吖啶类化合物发光体系和碱性磷酸酶催化的1，2-二氧环己烷发光体系。吉林检验检疫局建立的化学发光技术使用吖啶酯标记核酸探针。　　利用化学发光杂交保护分析的原理检测空肠弯曲菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、大肠杆菌O157和金黄色葡萄球菌4种致病菌特异性RNA序列，这种方法无需物理分离，利用吖啶酯标记DNA探针，通过核酸杂交保护分析法，即应用人工合成的靶DNA保守区的寡核苷酸，在合成时引入一个烷氨基的手臂，经活化后接上吖啶酯，制成化学发光探针。　　杂交后无需分离步骤，而是利用差分水解来鉴别，即加入碱性溶液，游离的发光探针遇碱水解失去发光特性，而与特异性目的片段结合的探针形成DNA-RNA杂交体，由于吖啶酯是平面结构很容易进入双螺旋的内部而获得杂交保护，水解速度缓慢(半衰期达10分钟以上)，仍有发光性能，可以在发光仪上显示化学发光信号，从而实现对病原菌的检测。　　应用前景广阔　　该项目利用胶体金技术研制了胶体金检测试纸条，用于单核细胞增生性李斯特氏菌的快速检测，该检测试纸条的灵敏度高，具有很强的特异性，不同批次生产的免疫胶体金具有良好的检测重现性，稳定性好，操作简单，检测时间只需10至20min即可报告结果，胶体金法无污染，不会危害操作者以及环境。胶体金抗体复合物在冻干状态下室温储存相当稳定，有效期长 此外胶体金技术还具有检测迅速、灵敏、不需要复杂仪器设备、产品永不褪色等优点，适合于食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的初筛检验。　　吉林检验检疫局建立的基因探针化学发光检测方法可在30分钟内快速确定病原体，并可直接于固体或液体培养基上鉴定目标微生物。该方法可直接应用于国外生产的LEADER 50i检测仪上，仪器自动注入检测试剂，立刻测量标记物所产生化学反应的化学发光强度，并自动计算结果及打印报告，该检测方法敏感性高，特异性强，检测成本低，操作简便、快速，对我国食品安全快速检测和监控工作具有重要意义，具有广泛的推广前景。胶体金快速检测试纸

大家好，我是流式荧光崔工，一个旨在链接与流式荧光相关的朋友，一起赚钱、一起学习、一起工作、一起生活的靓仔。——流式荧光崔工前段时间，有很多新关注崔工公众号的朋友问崔工一个问题，什么是流式荧光检测技术？它的原理是什么？传统的化学发光检测技术又有什么？问崔工这个问题的朋友应该是刚进入到这个行业，还不是很了解这个行业。今天就跟大家聊聊，供大家参考。— 1 —什么是流式荧光检测技术？从百度百科了解到，流式荧光，又称悬浮阵列、液相芯片等，是近20多年逐渐发展起来的多指标联合诊断技术。该技术以荧光编码微球为核心，集流式原理、激光分析、高速数字信号处理等多种技术于一体，多指标并行分析，最多可一管同时准确定量检测2-500种不同的生物分子。具有高通量、高灵敏度、并行检测等特点。可用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体、配体识别分析等多方面、多领域的研究。流式荧光检测技术的原理是什么？将荧光标记后的单细胞（或颗粒）悬液进入吸样管，进而随鞘液进入流动室。进入流动室之前的管道变细，迫使鞘液从四周、样本在中心进入流动室，在外加压力的作用下由下向上（或由上向下）直线流动。鞘液充满流动室将样品裹挟，当二者通过流动室喷嘴流出时，压力迫使鞘液包裹的液滴包含单一细胞或颗粒垂直通过检测区。在检测区与液滴垂直的位置设置激光，在与激光垂直的位置设置探测器（透镜等），液流、激光、探测器互相垂直并聚焦于一点实现流体动力聚焦。荧光标记的细胞或颗粒在激光激发下发出散射光和荧光的发射波，散射光和发射光被检测器获取，再经一系列滤光片、光栅处理去除干扰并将光信号经光电转换和放大后输入计算机，并由软件分析处理。而细胞分选则是对荧光标记的目的分子分别加载正或负电荷，当其在随液滴滴落的过程中受到外加高压电场的作用发生偏转而落入接收容器，从而获得目的细胞群。流式荧光检测技术有什么技术特点？1、高通量：将许多种不同荧光编码的微球放在同一反应体系内，一次可同时检测2-500种生理病理指标，这与传统方法的逐个检测相比是质的飞跃。2、高敏感性：流式荧光技术最高的检测下限可达0.01 pg/ml，常规的酶联免疫吸附试验(ELISA)仅为μg级，比后者检测的灵敏度提高10—100倍。3、线性范围宽：检测的线性范围比常规的ELISA方法高10倍以上，可达3-5个数量级。检测浓度范围为pg-μg级。4、反应快速：因流式荧光技术的杂交或免疫反应在悬浮的液相中进行，反应所需的时间短(从2 h缩短到20—40 min)，杂交后常不用清洗，即可直接读数，所以检测效率高于固相杂交。5、重复性好：杂交发生在准均相液体环境中，其结果稳定，重复性非常好。检测时，抽取其中的100颗微球读数，最终的数据取其均值或中位值，这样可将误差减到最小。6、利于探针和被检测物的充分反应：由于液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，所以也更有利于探针和被检测物的反应。7、操作简便：流式荧光技术平台的整个反应过程只涉及加样和孵育，最后上机读数，操作步骤少，简单易用。— 2 —什么是化学发光检测技术？这里既然是跟流式荧光检测相比较的，那这里的化学发光检测技术指的是化学发光免疫分析技术。化学发光免疫分析：是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。化学发光检测技术的类型及原理化学发光检测技术的类型分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。直接化学发光免疫分析用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗 原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和 NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、 发光 。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生 的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。化学发光酶免疫分析酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶 如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成 固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物；经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析 （electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体，在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应，它包括电化学和化学发光两个过程。化学发光免疫分析技术的优势是什么？1、灵敏度高：灵敏度高是化学发光免疫分析关键的优越性。化学发光免疫分析能够检出放射性免疫分析和酶联免疫分析等方法无法检出的物质，对疾病的早期诊断具有十分重要的意义。2、宽的线性动力学范围：发光强度在4-6个量级之间，与测定物质浓度间呈线性关系。这与显色酶联免疫分析吸光度（OD 值）2.0 的范围相比，优势明显。虽然同位素放射免疫也有较宽的线性动力学范围，但是放射性限制其应用。3、光信号持续时间长：化学发光免疫分析的光信号持续时间可达数小时甚至一天，简化了实验操作及测量。4、分析方法简便快速：绝大多数分析测定仅需加入一种试剂（或符合制剂）的一步模式。5、结果稳定、误差小：样本本身发光，不需要额外光源，避免了外来因素的干扰（光源稳定性、光散射、光波选择器），分析结果稳定可靠。6、安全性好及使用期长：到目前为止还未发现化学发光免疫分析试剂的危害性；另外这些试剂稳定，保存期可达一年之久。以上是对什么是流式荧光技术检测与化学发光技术检测基本原理做了一个说明，供大家参考。【行业征稿】若您有生命科学、医药、临床等行业相关研究、技术、应用、管理经验等愿意以约稿形式共享，欢迎自荐或引荐投稿联系人：刘编辑word图文投稿邮箱：liuld @instrument.com.cn微信：JaysonXY（备注来意：投稿）（本文编辑：刘立东 点击查看KOL主页）

近日，中科院长春应用化学研究所徐国宝等科研人员的一项发明专利“环境友好的高灵敏电化学发光检测方法”获得了国家知识产权局的授权(专利号：200510016848.4)。　　联吡啶钌电化学发光标记分析是继放射分析、酶联分析、荧光分析和化学发光分析之后的新一代标记分析技术。它是基于高浓度的三丙胺与低浓度的联吡啶钌标记物发生电化学发光反应来进行生物分析，该技术由于具有灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力强、试剂稳定、重现性好等优点，被广泛应用于临床分析和科学研究。但联吡啶钌/三丙胺体系需要很高浓度的三丙胺才能实现高灵敏检测 且在不同工作电极上发光强度差别较大，铂电极上的发光强度仅约为金电极上的十分之一。因此十几年来人们一直在寻找替代三丙胺的新型共反应物，但一直没有找到发光效率高于三丙胺的共反应物。　　该研究小组针对标记分析的特定条件，调研了一系列含有不同链长和基团如羟基、羧基和氨基等的共反应物的发光情况，找到一种高效的新型共反应物二丁基乙醇胺。在浓度为20 mM时，它在金电极和铂电极上的发光强度分别约是目前效率最好的三丙胺的十倍和一百倍。与一般采用外加增敏剂提高发光效率不同，二丁基乙醇胺是通过自身的羟乙基的催化来显著提高发光效率。由于羟乙基是一个吸电子基，因此该研究表明不是所有吸电子基团都是抑制电化学发光的，为寻找更加优良的试剂提供了新途径。二丁基乙醇胺具有优良的分析性能，在浓度只有三丙胺的五分之一时检测联吡啶钌比三丙胺的检测限好一个数量级。该研究对联吡啶钌电化学发光标记分析具有重要意义。