磷酸氢钙分析

大家好，本周为大家介绍一篇发表在J. Am. Chem. Soc.上的文章，Transient Structural Dynamics of Glycogen Phosphorylase from Nonequilibrium Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry，文章作者是英国埃克塞特大学的Jonathan J. Phillips。　　变构调节指在蛋白质的正构位点上的变化通过蛋白质内部传递，最终影响到变构位点的结构，从而调整白质功能。理解蛋白质功能转换背后的特定结构动态变化对于分子生物学和药物发现领域至关重要。尽管变构现象自从提出以来已有广泛的研究，但是关于信号如何在蛋白质内部长距离传递的具体机制仍然不甚清楚。很大程度上是由于缺乏能够在时间和空间上高分辨率测量这些信号的生物物理方法。糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase，GlyP)是研究变构调节常用的标准蛋白，GlyP与II型糖尿病和转移性癌症的治疗密切相关。GlyP作为一种典型的变构酶，其活性受磷酸化修饰、多种天然配体和药物的调控。本文旨在通过开发和应用非平衡毫秒级氢/氘交换质谱(neHDX-MS)技术，来精确定位GlyP在变构激活和抑制期间的动态结构变化。这项技术能够提供蛋白质在毫秒时间尺度上的局部结构动态信息，有助于揭示变构调节过程中的瞬态结构特征，从而为理解蛋白质的动态行为和设计变构调节剂提供重要的结构信息。　　作者首先确定了能够完全激活或抑制GlyP的条件。25 mM 的AMP能实现GlyPb的最大激活(图1A)。32 mM咖啡因足以完全抑制GlyPa(图1B)。并且观察到50ms内AMP和咖啡因能够达到最佳激活/抑制状态(图1C和1D)。　　图1.糖原磷酸化酶b的变构激活和糖原磷酸化酶a的抑制。　　随后作者通过neHDX-MS捕捉由AMP引起的GlyPb变构激活过程中的局部结构扰动。通过激活过渡态与未激活和激活状态之间的HDX差异，作者将这些肽段分成了七个类群。其中重点值得关注的类群是c、d(其他类群对应区域及趋势不在此详细介绍)，因为他们的HDX行为与未激活和激活时的稳定态都有明显差异，这些局部区域的结构变化是过渡态的独特体现(图2A)。其中，c类群主要涵盖了tower helix区(图2B)，说明该区域在从未激活到激活状态的过渡态中，表现出相较于前后二者皆较高的动态性。d类群涵盖活性位点，说明活性稳点结构在因结合发生了结构稳定化现象。为了从原子水平理解这些瞬态结构变化，研究人员使用了一种基于Energy Calculation and Dynamics(ENCAD)的方法，Climber，来模拟从非活性状态到活性状态转变过程中的过渡态内部作用变化。结果显示，tower helix在激活过程中经历了氢键先断裂后形成的变化，这与观察到的HDX增加相一致(图4A)。　　图2.GlyPB中表现不同结构动力学行为的类群。　　图3.局部区域HDX动力学。　　图4.GlyP在活性和非活性状态之间的结构插值。　　随后作者探讨了咖啡因如何通过变构抑制影响GlyPa的结构动态。同样作者也比较了抑制过渡态与未抑制和抑制状态之间的HDX差异，分成了七个类群。在这几组类群中，仅有m表现出较未抑制和抑制状态都较明显的氘代上升趋势(图2C、图3C&D)。m区域涵盖了tower helix区(图2D)，说明该区域在未抑制状态到完全抑制状态的过渡阶段内，发生了局部去结构化现象。此外，在280s loop和250′ loop区域也表现出类似的瞬时去稳定化现象。结合AMP激活实验中的现象表明，尽管咖啡因和AMP作用于GlyP的不同位点，但它们都可能通过类似的变构路径(即tower helix的去稳定化)来引起GlyP的变构调节，从而实现对该蛋白功能的调控。同样在Climber分析中，可以观察到对应区域发生了氢键重排，与neHDX-MS结果呼应(图4B)。　　本文讨论了GlyP的变构调节中间态涉及的局部结构动态变化，并通过毫秒级neHDX-MS揭示了这些变化。结果表明激活和抑制过渡态都涉及到tower helix的氢键断裂和局部结构重排，这是两个途径的共同特点。本研究的亮点在于开发了一种新的neHDX-MS方法，能够在毫秒时间尺度上观察蛋白质的变构结构动态。这种方法不仅对理解GlyP的变构机制具有重要意义，而且可以广泛应用于不同蛋白质的变构研究，为理解蛋白质的变构调节提供了新的视角和工具。　　撰稿：罗宇翔　　编辑：李惠琳　　文章引用：Transient Structural Dynamics of Glycogen Phosphorylase from Nonequilibrium Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry　　参考文献　　Kish, M. Ivory, D. P. Phillips, J. J., Transient Structural Dynamics of Glycogen Phosphorylase from Nonequilibrium Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 2023, 146 (1), 298-307.

仪器信息网讯 近日，中国科学院大连物理研究所生物分子高效分离与表征研究组(1810组)张丽华研究员和张玉奎院士团队，蛋白组组学分析最新成果发表于《自然-通讯》(Nature Communications)上。团队发展了N-磷酸化肽段高选择性富集新方法，并结合肽段的高效分离和高灵敏度鉴定，实现了N-磷酸化蛋白质组的深度覆盖分析。　　与研究相对深入的发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸侧链氨基上的蛋白质O-磷酸化修饰相比，发生在蛋白质组氨酸、精氨酸和赖氨酸上的N-磷酸化修饰，由于P-N酰胺键具有较高的吉布斯自由能，且易发生水解，目前仍缺乏有效的N-磷酸化蛋白质组分析方法，制约了人们对其生物学功能的认识。　　团队研制了具有核壳结构的亚二微米硅球，并通过在硅球表面键合双二甲基吡啶胺双锌分子，在中性条件下实现了N-磷酸化肽段的高效、高选择性、快速富集 通过基于该材料的on-tip富集方法和液质联用分离鉴定的结合，不仅从HeLa细胞中鉴定到3384个N-磷酸化位点(目前最大的哺乳动物N-磷酸化数据集)，而且还发现N-磷酸化位点附近亮氨酸高度表达 建立的N-磷酸化蛋白质组分析新方法不仅为深入研究其生物学功能提供了基础数据，而且也为推动精准医学、合成生物学等领域的发展提供了技术支撑。　　上述工作得到国家自然科学基金、国家重点研发计划、中科院大连化物所创新基金等项目的资助。文章链接：《自然-通讯》(Nature Communications)。

磷酸根分析仪测试方法　　离子在固定相和流动相之间有不同的分配系数，当流动相将样品带到分离柱时，由于各种离子对离子交换树脂的相对亲合力不同，样品中的各离子被分离，继而进入抑制器。抑制器的作用主要是降低洗脱液的本底电导，增加被测离子的电导响应值和除去样品中的阳离子，再流经电导池，由电导检测器检测并绘出各离子的色谱图，以保留时间定性，峰高或峰面积定量，测出离子含量。　　下面讲讲仪器的操作使用步骤：　　一、仪器的校准：仪器校准分为空白校准和曲线校准。　　二、水样的测定方法。　　1、待测水样的显色：取水样50mL注入塑料杯中，加入5mL试剂，混匀后放置3分钟即可。　　2、水样的测量：　　(1)做一次空白校准。　　(2)在仪器处于测量画面状态下，倒入显色后的待测水样，仪器显示当前测量水样的磷酸盐含量。　　(3)待该数值稳定且确认为有效后，用“+”或“–”键选择欲存入的通道数，按“存储”键，该值将自动存储到相应的通道中。　　(4)如果认为该数值无效，可按“排液”键，将液体排空，做一次空白校准。在仪器处于测量画面状态下，倒入显色后的待测水样，仪器显示当前测量水样的磷酸盐含量。