组合填料

文/Tosoh Bioscience应用专家Jonas Wege 单克隆抗体是目前生物制药行业中成熟的靶向分子，适用于治疗各种疾病，且生产便捷、易于放大。然而，生物制药的创新者并没有安于现状，而是不断推动当前疗法背后的科学进步。抗体片段是目前最具前景的一种形式，不仅能够改善靶向点位，还能够提高亲和结合力。另外，工程技术的不断进步也推动了抗体片段重组生产变得更加经济。抗体片段是相对较新的技术，正确的分析和纯化对于为患者提供安全、有效的治疗至关重要。我们的生物制药合作伙伴不仅信赖Tosoh Bioscience高质量的色谱解决方案；他们还相信我们的专家能够帮助他们开发最具性价比效益的工艺流程。 减轻负担生物制药厂家一直致力于在抗体捕获阶段生产更高浓度的产品，继而保证后续所有操作（包括精制）具有更高的成本效益和时间效率。然而这是一个史无前例的挑战，因为片段无法与Protein A（依赖于Fc结合）等传统层析填料结合。目前来说，Protein L是应对这类纯化挑战的第一选择。Protein L填料基质表面的蛋白质通过Kappa轻链（存在于许多抗体片段中）与抗体结合来清除杂质。尽管Protein L非常适合纯化抗体片段，但与Protein A相比，Protein L仍然属于一种新型的层析介质。开发人员报告称，传统的Protien L填料表现出的动态吸附载量更低。简而言之，最终只有少量的靶向分子能够吸附到层析柱中，进而限制了层析柱的性能，导致抗体捕获步骤更加昂贵、更加费时。制造商面临的另一个潜在难题是填料在重复清洗过程中的化学稳定性较低。层析柱运行后，通常需要使用碱性溶液进行清洗。然而，传统Protein L填料化学稳定性差，往往会导致性能部分损失。为应对该问题，就需要在清洗少量次数后更换填料，导致成本升高、工作量增加。 为了应对挑战，东曹开发了一种行业领先的耐碱性Protein L层析填料——Toyopearl AF-rProtein L-650F。其设计首先考虑到了高动态吸附载量，意味着层析柱中的填料能吸附更多蛋白，纯化相同数量靶向分子需要的运行次数更少。事实上，我们的Protein L亲和填料对Fab的动态结合载量在任何驻留时间内都至少是其他市售填料的两倍以上，这显然更有助于提高生产效率和生产力。我们不仅研究了填料在抗体片段捕获步骤中的性能，还探讨了填料在整个纯化过程中的可重复使用性。由于提高了填料的耐碱性，因此可以在同一色层析柱上运行多次纯化循环。最后，我们还针对不同的清洗方案进行了广泛的试验，加上我们在填料方面的专业知识，极大地提高了产品的纯度和填料的寿命。因此，我们的生物制药合作伙伴所需的填料更少，能够将更多资源用于开发最有效的工艺过程，并且借助我们的专业知识尽快完成工艺开发。 成功背后的科学虽然我们的Protein L填料促进了抗体片段捕获工艺的革新，同时我们也认识到了持续改进的迫切性，对东曹来说，这意味着我们将持续专注于高质量的研发。事实上，不论是我们内部的独立研究，还是与外部伙伴的合作，我们一直奋战于多个更加广泛的研究项目，旨在优化整个工艺流程的生产效率。比如，目前我们正在评估如何将Protein L介导的捕获步骤转移到连续流色谱中。我们期望这种具有成效的、高效的选择能够为我们的客户带来无限可能。 最重要的是，东曹始终致力于开发更加高效的抗体片段纯化解决方案。凭借悠久的历史经验和丰富的技术专长，我相信我们是寻求节省成本和提高生产率的药物研发公司的最佳合作伙伴。解决方案 Wacker Biotech（瓦克生物技术）是WACKER Group下属的负责生物制药业务的公司。该公司在使用大肠杆菌作为表达系统生产抗体片段方面有着多年的经验。但这一过程并非没有挑战。这里，Wacker Biotech的业务发展经理Ilona Koebsch和下游工艺专家Thomas Walther就该公司面临的一些生产挑战，以及东曹是如何协助其开发解决方案方面进行了阐述。 最有趣的抗体片段亚型是什么？ Koebsch：抗体片段的尺寸、结构和功能各不相同。但是，从治疗角度来看，Fab和所有包含抗原结合位点的变体算得上是最有趣的抗体片段技术的代表。值得注意的是，片段尺寸足够小，才能穿透组织，这对于许多治疗和免疫组织化学来说是必不可少的。另外，由于这些片段相对较小，使用原核表达系统（如大肠杆菌）进行生产也更加容易，更加经济。生产Fab面临的主要挑战是什么？ Walther：根据结构的不同，Fab既可以是可溶性的，也可以组装成包涵体（聚集的结合蛋白）。生产厂家还必须在发酵及下游工艺中保持其折叠和结构，确保Fab具有生物活性。对于上游工艺，主要任务始终是找到表达系统（宿主和质粒）和培养参数的最佳组合，以实现高效、稳健的生产工艺。但是，在我看来，最关键的挑战是找到合适的模型来模拟特定结果，或是在实验室规模下模拟大规模生产过程。在下游工艺中，挑战主要包括样品结构的复杂性、开发时间的长短以及亲和填料对大多数常见清洗方案的低耐受性。WACKER是如何应对这些挑战的？ Koebsch：WACKER开发了两种独特的基于大肠杆菌的表达系统，能够高效生产不同的抗体片段。ESETEC是一种独特的表达系统，可控制发酵液中正确折叠的重组蛋白产品的分泌。简而言之，这有助于简化初级回收和纯化过程，从而降低产品成本。我们还针对疏水性抗体片段开发了FOLDTEC技术。该技术包括高效的大肠杆菌菌株、不含抗生素与噬菌体的质粒保持系统，以及全面的复性技术。我们没有相关的专利技术来解决下游工艺中存在的难题。高通量、良好的分辨率、低背压、易于操作（就柱填料而言）、洗脱时间短、使用寿命长、非特异性吸附低，这一切对于层析填料来说都是必不可少的！东曹是如何协助WACKER应对这些挑战的？ Walther：我们在一个项目中使用了我们以前的首选填料，但由于吸附载量太低而失败了。此时，我们在WACKER其他分公司同事的推荐下，使用了东曹的AF-rProtein L-650亲和填料。我们将东曹的填料与其他三种声称可以特异性结合Kappa轻链的填料进行了比较。我们发现，AF-rProtein L-650填料的结合能力明显高于竞品（约3倍），而且目标蛋白的回收率也更高。同时，蛋白杂质的含量也是测试填料中最低的。最后，AF-rProtein L-650的流速也明显优于其他测试填料，这使我们能够用更小的柱体积来装填填料，为我们的客户带来了真正的成本优势。我们还得到了东曹填料和技术销售专家的大力支持，在为填料产品选择合适型号的层析柱方面获得了建设性的建议。很明显，东曹Protein L对于其他同类填料是一个强大的竞争对手，它应该会让其他供应商重新考虑他们当前的产品阵容。文章来源：The Medicine Maker：https://themedicinemaker.com/fileadmin/issues/1021_TMM_Issue.pdf

使用GC-MS以及X射线荧光光谱法、X射线衍射法和偏光显微镜，西北大学文化遗产学院和秦始皇陵遗址博物馆(西安)的科学家测定了用作兵马俑结构的一种胶和填充物的多官能的材料的组成。　　神秘的多功能材料　　1974年，西安市的一群农民挖井时，发现了兵马俑泥塑的片段。继他们的发现，考古学家访问了遗址，并通过多年的渐进而细致的工作，挖掘出7000个兵马俑雕像，这是迄今发现的最大的雕塑葬集合。每个兵马俑雕像都是独一无二的，有不同的发型、脸部、衣服、高度、面孔和姿势。现在，这里是著名的联合国教科文组织世界文化遗产。兵马俑围绕秦始皇——中国的第一个皇帝，保护他死后的陵墓。秦始皇统一许多较小的战国，标志着现在中国开始，并开始了长城的建设。　　兵马俑雕像是真正了不起的，包括军事人物，比如战士、武器和马匹，还有杂技、力士和音乐家，据推测，这些是为了迎接来世的皇帝。陵墓和游客中心已经展出挖掘的雕像，他们也已经在世界各地展览。 自从兵马俑被发现以来，遗物获得了广泛的科学和考古学兴趣，期待揭示中国在秦皇时期人民生活的丰富细节。　　在雕像中发现了一种多功能材料，为均质的蓝灰色粉末，与颜色灰度陶器相似。在士兵塑像中，在战士和它的搁脚板之间发现了这种蓝灰色粉末。在武器和身体部分，颈部和头部等部份，套筒和手掌之间都有所发现。 在马雕像上，在其头部和颈部，上腹部和四肢和蹄之间，也发现了这种材料。 这些材料似乎是秦雕像建设中的重要组成部分，但迄今为止，它尚未在任何深度上进行调查。西北大学文化遗产学院和秦始皇陵遗址博物馆的专家采用了一系列的分析方法，来研究这种材料的组成，并揭示其功能。 X射线荧光光谱法(XRF)和X射线衍射光谱法(XRD)用于研究无机组分，偏振显微镜(PLM)提供了有关矿物外观和晶粒尺寸的细节，以及用于烧制材料的温度 。 GC-MS用于鉴定有机组分。　　GC-MS识别有机粘合剂　　通过用碳钢外科手术刀片刮擦，将赤土陶器战士和赤陶马的多用途材料的样品，收集在医疗勺里。 将样品密封在玻璃管中，并冷藏保存，直至需要用于分析。为了比较，还制备了焙烧土、模拟陶器和陶器碎片的样品。　　采用GC 7890-MS 5975仪(安捷伦，USA)进行GC-MS分析，仪器配备有EI离子源和四极质量分析器。首先，使用氨提取样品并在C4固相，然后在真空下放置用6mol/L 盐酸水解纯化。然后在5分钟内将样品加热至160°C，并保持30分钟。将得到的水解产物在氮气流下干燥，并使用MTBSTFA用1%TMCS衍生化。十六烷和N-亮氨酸用作内标，并采用定量的标准曲线法。　　XRF和XRD测定表明，该材料的无机成分为SiO2、Al2O3和Fe2O3，以及一些K2O、MgO和CaO，石英、钠长石和钾长石为主要的矿物相，如通常的陶器。因此，兵马俑雕像的无机成分与用于制造它们的粘土相同。 PLM和PETROG进一步表明地面陶器在材料中存在。　　GC-MS能够识别在粘合材料中起特殊作用的有机组分。 在所有样品中，发现有低水平的0.0023%至0.0212%的蛋白质。对含有蛋和动物胶蛋白的所有样品，使用氨基酸比和PCA来鉴定蛋白质的来源。 需要进一步的工作来确定是否使用了全蛋、蛋黄或蛋白，或者其他有机物质(其他蛋白质，脂质或多糖)可能已经存在。　　结果表明，该材料的主要功能是作为一种粘合剂或胶水，当初，分别制造了雕像的各部分，然后连接在一起。 此外，裂缝部件之间的材料的存在，强烈地表明其应用作为胶水。 另一种拟议的用途是用于平滑粗糙的表面，如马雕像的腹部所见。 研究人员认为无机填料和有机粘合剂的组合赋予了多功能性质的材料。　　促进未来的复原　　该研究采用一系列多种分析技术，揭示了兵马俑建设中使用的多功能材料的组成。 有机粘合剂与无机填料的组合，显示了工匠的创造性和智慧性，毫无疑问，这对复原秦朝兵马俑非常有用。　　相关链接　　[1] Ge R, Yang L, Shen M, Sun W. Investigating the Composition and Application of an Ancient Multipurpose Material Discovered on the Qin Terracotta Army Statues. Archaeometry. 2021. https://doi.org/10.1111/arcm.12712　　[2] Cohen A. Artsy: Why China’s First Emperor Built, Then Buried, a 7,000-Strong Terracotta Army. (https://www.artsy.net/article/artsy-editorial-chinas-first-emperor-built-buried-7-000-strong-terracotta-army accessed 9 August 2021).　　Wikipedia: Terracotta Army. (https://en.wikipedia.org/wiki/Terracotta_Army accessed 9 August 2021).　　From：Wiley Analytical Science, Spectroscopy, August 24, 2021　　(编译：符斌 北京中实国金国际实验室能力验证研究中心研究员)

近日，赛分科技成功开发了首款亲和层析填料——MabPurix™ Protein A，该填料以琼脂糖凝胶为基质，表面键合配体Protein A，主要应用于生物制药领域——抗体的纯化。作为全球色谱产品最为完善的企业之一以及生物分离色谱的领航者，赛分科技十分重视新产品研发，目前的色谱分离填料已涵盖反相、正相、离子交换、手性、体积排阻、亲和、HILIC、离子排斥、配体交换等十几种类型，产品品种齐全，性能优越。其中，色谱填料产品包括硅胶基质和聚合物基质两大类，几十小类，可根据客户实际需要分别应用于不同的领域中。本次所开发的MabPurix™ Protein A填料是赛分科技推出的首款亲和层析填料，也是首次推出的以琼脂糖凝胶为基质的填料，此前，赛分科技的填料基质包括球形硅胶、不定形硅胶、聚甲基丙烯酸酯、PS/DVB等。与其它基质相比，琼脂糖基质填料具有更好的生物相容性。MabPurix™ Protein A的加入使得赛分科技的产品品种更加齐全，尤其对于生物分离色谱产品家族里，MabPurix™ Protein A的成功推出具有里程碑的意义。赛分科技的聚合物基质填料家族MabPurix™ 亲和层析填料 MabPurix™ 亲和层析填料专为大规模抗体纯化而设计，是由高纯度Protein A与高交联度琼脂糖偶联后的产物，用于从血清、腹水、细胞培养上清和细胞提取物中分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc片段的基因工程重组蛋白。Protein A是金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白，单链，它通过与免疫球蛋白的Fc区相互作用，可结合大多数哺乳动物的IgG，尤其对人IgG1、IgG2、IgG4，小鼠IgG 2a和IgG 2b具有高亲和力。MabPurix™ Protein A亲和层析填料具有高稳定性、高选择性、高效率的特点，是抗体纯化的优选。● 可根据用户的需要提供各种规格的预装柱；● 强化基质保证了高流速、低背压；● 特殊设计的定向键合技术保证了高的载量；● 可耐受苛刻的在线清洗条件；● 可以很容易的由小规模的实验室制备向大规模的工业化生产进行线性放大。更多信息请登录：http://www.sepax-tech.com.cn/products/gytl/juhe/infinity/99.html关于赛分科技 赛分科技有限公司（Sepax Technologies, Inc）总部位于美国特拉华州高新技术开发区，致力于开发和生产药物与生物大分子分离和纯化领域的技术和产品。赛分科技是集研发、生产和全球销售为一体的实业型企业。公司主要产品为液相色谱柱及耗材、固相萃取柱（SPE）及耗材、液相色谱填料以及分离纯化仪器设备。在液相色谱领域里，赛分科技已开发出了100多种不同型号的液相色谱材料，涵盖了反相、正相、超临界（SFC）、手性（Chiral）、离子交换、体积排阻、亲和、HILIC等各种类别，为世界范围内液相色谱产品最为完善的企业之一。 赛分科技的创新技术使之生产出具有最高分辨率及最高效的生物分离产品，包括体积排阻、离子交换、抗体分离、和糖类化合物分离色谱填料和色谱柱，可广泛地应用于单克隆抗体、各种蛋白、DNA、RNA、多肽、多糖和疫苗等生物样品的分析、分离和纯化。赛分科技先进的技术和完善的产品线已使赛分成为全球生物分离的领航者。 公司网站：www.sepax-tech.com.cn www.sepax-tech.com