活性白土

[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=74257]HG/T 2569-2007 活性白土[/url]

70kDa）中的七个得到了可溶性表达，而其它的融合标签（GST，MBP和hexahistidine）系统则只得到了四个可溶性表达的蛋白。表1. 用大量的目标蛋白评估NusA标签对提高融合蛋白可溶性的作用参考文献a目的蛋白数目目的插入序列种属目标蛋白大小范围NusA融合蛋白可溶性比例Shih等（2002）40酵母，哺乳动物，植物，昆虫9-10060Korf等（2005）75人6-12760bKohl等（2008）96人1-11844ca. Korf等和Kohl等的研究中包含了六组氨酸标签。b. 可溶性蛋白量大于等于10%即认为该融合蛋白可溶。c. 纯化后的融合蛋白如果在SDS-PAGE后考染在合适位置出现条带即认为可溶。Korf等的还发现对于定位于真核细胞细胞器，质膜或者骨架的蛋白，相对于其它标签系统来讲，NusA标签是最好的可溶性表达的选择。Kohl等（2008）也发现只要在20-25℃诱导表达，NusA标签能够大大提高难表达的蛋白比如膜蛋白的可溶性。与Korf等的研究结果一致，Kohl等也发现25℃诱导表达比30℃或37℃诱导表达可以纯化得到更多的NusA融合蛋白。切除NusA标签获得后保持活性且正确折叠的蛋白表2总结了16个采用NusA标签成功获得可溶性蛋白，在切除标签后这些蛋白仍有正确折叠结构和活性。大部分这种研究是是关于分子量小于或接近20kDa的目标蛋白。纯化后的目标蛋白产量范围在1.5-100mg/L。趋化因子和细胞因子可以得到高达30-100mg/L的产量。其它关于这些蛋白表达和纯化的有参考价值信息包括：■ 植物磷酸烯醇式丙酮酸—羧化酶激酶（Ermolova 2003）——目标蛋白切除标签后用BDA（蓝色葡聚糖）亲和层析树脂纯化。纯化后蛋白的催化活性比未切除标签的融合蛋白高50倍。■ Xklp3a，Tep3Ag和E8R（De Marco 2004）——用蛋白酶切割后，His-融合的TEV和NusA被Ni2+离子亲和色谱选择性去除。与Ni2+亲和结合的标签被紧密地结合在树脂上，在流出液中则可以得到纯化的目的蛋白。所有这三种蛋白在纯化后都正确折叠且均一分散在溶液中。纯化的膜结合蛋白E8R牛痘病毒蛋白在Tris缓冲液中除去NusA后出现了沉淀，然而加入0.02%的月桂酰基麦芽糖苷和150mM的氯化钠后，蛋白又重新变得可溶。■ 环麦芽糖糊精酶（Turner 2005）——这个蛋白属于α-淀粉酶家族。这个家族的蛋白通常在大肠杆菌中很难以活性形式表达出来。将其与肠激酶混合孵育24小时以上会使其活性逐渐增强，直到达到未经肠激酶处理过的融合蛋白的2倍以上，这也说明标签的存在降低了该酶的活性。可以用固化了Cu2+的亲和层析柱去除切除的融合标签。■ 八种人趋化因子（Magis-trelli 2005）——所有的蛋白都在OrigamiTM B菌株中表达提高它们在胞质中的二硫键形成率。在趋化因子编码序列的C端引入了AviTMTag（亲和素）生物素化序列。切割后的细胞趋化因子可以用单体的亲和素树脂亲和层析与切割下的NusA标签和蛋白酶混合物分离开。所有切割纯化后的蛋白在细胞趋化实验中都显示了活性，而没有一个融合蛋白有这样的活性。■ 蚯蚓血红蛋白（Karlsen 2005）——酶切后，用分子筛分离纯化蚯蚓血红蛋白，纯化后的蛋白通过圆二色谱检测得到的α-螺旋结构与模型预期结果一致，且纯化后的蛋白可以以单体的形式稳定保存。■ 人白介素-29（Li 2006）——用S-蛋白亲和层析比Ni2+亲和层析可以得到更纯的目的蛋白。将融合蛋白N端的NusA/His•Tag®/S•Tag™标签切掉后，用链亲和素琼脂去除生物素标记的凝血酶。用水疱性口膜炎病毒（VSV）处理固定的人羊膜上皮细胞（WISH 细胞）后，通过检测纯化的IL-29对细胞的保护效应来检测其抗病毒活性。■ 人干扰素-λ2（Li 2007）——酶切后，用Novagen提供的EKaptureTM琼脂除去重组的肠激酶。先用纯化后的干扰素-λ2处理WISH细胞，24小时后加入VSV病毒，可以观察到干扰素-λ2可以有效地保护细胞免于病毒介导的病变。表2. 切除NusA标签获得后保持活性且正确折叠的蛋白参考文献目的蛋白目的蛋白分子量（kDa）切割用蛋白酶融合蛋白亲和层析固定介质纯化后目的蛋白产量（mg/L）Ermolova等（2003）植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶32凝血酶Ni2+1.5De Marco等（2004）Xklp3ATep3AgE8R15NRa32bTEV酶TEV酶TEV酶Ni2+5.02.54.0Turner等（2005）环麦芽糖糊精酶69肠激酶Cu2+1.6Magistrelli等（2005）八种人趋化因子8-21Xa因子Ni2+30-100Karlsen等（2005）蚯蚓血红蛋白15TEV酶Ni2+NRaLi和He（2006）人白介素-2920凝血酶S-蛋白60Li和Huang（2007）人干扰素-λ220肠激酶Ni2+65a. 未报道b. 根据NCBI报道预测的全长蛋白分子量与NusA标签融合且具有活性的蛋白 与这些切除NusA标签后保持活性且正确折叠的蛋白不同，还有很多报道指出目的蛋白在“NusA-目的蛋白”的融合形式时具有很好的活性。比如单链（ScFv）催化活性抗体14D9（Zheng 2003），来自Aequorea victoria的绿色荧光蛋白（Nallamsetty 2006），人二氢叶酸还原酶（Nallamsetty 2006），来自Ensis directus蛏子的精氨酸酶激酶（Compaan 2003），来自B. thuringiensis的修饰δ-内毒素（Kumar 2005），人BCMA跨膜受体（Guan 2006），植物α-双加氧酶1（Liu 2006），以及来自Plasmodium falciparum的b-ketoacyl-acyl载体蛋白合成酶（Lack 2006）等，反映了各种不同背景的蛋白都显示出了与NusA标签融合后的活性。NusA标签提高蛋白可溶性的可能机制 Houry（1999）等揭示NusA蛋白是分子伴侣GroEL在体内的必须底物。而GroEL与其共作用因子GroES是大肠杆菌唯一的在所有生长条件下必需的分子伴侣系统。Douette等（2005）研究了融合蛋白NusA-UCP1（uncoupling protein 1）的可溶产量。UCP1是一种线粒体膜蛋白。这些作者发现16℃培养时，当GroEL共过表达的情况下，融合蛋白的可溶性有更大的提高。这个结果也表明NusA与分子伴侣途径相作用，从而阻止参与蛋白的聚集。总结 已有充分的证据证明NusA标签系统能显著提高多种不同来源蛋白的可溶性表达，而这些蛋白在单独表达时往往形成不可溶的包涵体。在一些研究报告中，用蛋白酶切除NusA标签能使目的蛋白仍保持正确折叠和生物学活性；相反，在另外许多报道中也指出当目的蛋白与NusA融合而非切除时，融合蛋白也同样具有活性。NusA标签系统的成功至少部分地是由于其与大肠杆菌分子伴侣系统相互作用的结果。

[align=center][b][font=宋体]植物活性美白成分的研究进展何文[/font][/b][/align][font=宋体]摘要：伴随着我国化工企业的发展，植物活性美白成分研究有了很大进展。皮肤白皙是东方女性所共同关注的话题。由于一些化学的美白成分具有刺激性、致敏性及不良反应大等缺点，很难满足广大消费者的需求。本文综述了植物美白机理，黑色素生成的机理，同时，论述了植物活性美白成分的研究进展。[/font][font=宋体]关键词：植物；活性美白；成分；研究进展[/font][font=宋体]引言[/font][font=宋体]近年来，人们对化妆品的需求越来越大，使得化妆品市场发展迅速，同时美白护肤的理念逐渐深入人心，特别是女性一直都追逐向往白皙的皮肤，光滑无疤痕。但是由于各种因素的影响，如遗传、饮食习惯以及内分泌失调等，导致人体代谢失调，黑色素生成紊乱，从而出现各种皮肤斑痕，甚至导致疾病。传统的美白化妆品由于生产工艺的原因，含有某些毒性成分，存在安全问题，所以被限制使用。随着人们对天然植物提取活性成分的开发和拓展，人们发现它具有安全无毒的特点，天然化妆品的研究已经逐渐成为国内外研究的热点之一。本文就植物活性成分对黑色素生成的抑制作用，展开一系列的研究和综述，为今后的试验和开发拓展提供理论基础。[/font][font=宋体]1[/font][font=宋体]、美白机理[/font][font=宋体]根据黑色素的形成过程，可以通过以下几种方法达到皮肤美白的作用：[/font][font=宋体]（1）抑制黑素细胞的增殖；[/font][font=宋体]（2）抑制酪氨酸酶、多巴互变酶及氧化酶的活性；[/font][font=宋体]（3）还原黑色素形成过程各中间体，或与之结合阻断黑色素的形成，阻断二羟基吲哚聚合为黑色素；[/font][font=宋体]（4）抑制黑色素颗粒转移至角质形成细胞；[/font][font=宋体]（5）加速角质形成细胞中的黑色素向角质层转移，软化角质层和加速角质层的脱落；[/font][font=宋体]（6）减少紫外线、氧自由基等外源性因素对黑色素形成的负面影响。[/font][font=宋体]目前公认的植物提取物美白作用主要通过前两个途径来影响的，而与后几个途径有关的活性成分还有待于进一步开发。[/font][font=宋体]2[/font][font=宋体]、黑色素生成的机理[/font][font=宋体]黑色素体是人体皮肤组织细胞的一种细胞器，可以合成和储存黑色素。其中，黑色素细胞是黑色素生成的主要来源，主要分布在皮肤表层、毛发和中枢神经系统等组织。黑色素全部合成在黑色素体中，一般黑色素的生成可以抵制太阳紫外线的照射，防止过度的灼伤和皮肤癌的产生，调节代谢。然而黑色素过度沉着会导致黑斑、老年斑及雀斑的产生，甚至会诱发黑色素瘤的形成，过去的研究显示体内黑色素失调可能会引发各种神经退行性疾病，主要有阿尔兹海默症和帕金森症。但是人体内黑色素含量过少也可能引发白癜风和白化病。[/font][font=宋体]黑色素的生成主要是由以下三种酶调控：酪氨酸酶、多巴色素异构酶、黑色素前体氧化酶。酪氨酸酶是最重要的一类限速酶，控制整个黑色素生成的快慢。黑色素合成过程如下：在细胞中，酪氨酸酶促进了L-酪氨酸羟基转化为L-多巴（3，4-二羟基苯丙氨酸），然后再将多巴胺氧化为L-多巴醌。然后多巴醌与一些生物大分子发生系列的反应生成白色的多巴色素，最后在一系列相关蛋白（TYR、TRP-1、TRP-2）和其他反应共同作用下最终形成黑色素。[/font][font=宋体]3[/font][font=宋体]、植物活性成分在美白中的发展历程[/font][font=宋体]过去在美白中常常应用一些如氢醌、杜鹃醇等“西药”，效果显著，但有一些会过分抑制黑色素的生成，引发皮肤颜色异常。[/font][font=宋体]古有《千金要方》中题作“治面黑黯皮皱皴散方”，《普济方》中记载的“七白散”，更有慈禧太后亲身验证的“玉容散”。上述古方均是中医组方，不仅说明了皮肤白皙是自古已有的追求，更是说明了自古便有利用中草药进行美白护肤的先例。研究表明，中草药提取物主要通过改善皮肤微循环、抑制黑色素生成以及抗氧化作用协同改善肤色，达到美白的功效，主要起作用的成分有多酚类、多糖类、黄酮类。中草药中的活性成分在抑制酪氨酸酶活性的过程中，多为竞争性抑制，改变酶活力，而不是降低有效的酶量来降低活性，对皮肤温和安全。[/font][font=宋体]从黑色素生成的机理来看，在酪氨酸酶这个环节上，既可以通过清除自由基来减少其参与酪氨酸酶的氧化过程，又可以通过抑制酪氨酸酶活性来减少黑色素生成。以酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率为综合指标评价美白功效，并设置相应的比例权重，以酪氨酸酶抑制率∶清除自由基=6∶4来定义美白度，此方式目前得到比较多研究者的认可与应用，并将比例调整为酪氨酸酶抑制率∶清除自由基=7∶3，可能是认为在黑色素的生成过程中酪氨酸酶的作用影响占比不止60%。[/font][font=宋体]4[/font][font=宋体]、植物活性成分的开发和应用[/font][font=宋体]4.1[/font][font=宋体]、植物萜类化合物[/font][font=宋体]植物精油是植物中特有的芳香成分，传统操作是以压榨、蒸馏而成，一般是芳香植物经过高度浓缩得到的产物，主要成分为萜类化合物，由于其分子量小，极易被人体吸收，有很强的美容美白的护肤功效。最常见的为柠檬精油和玫瑰精油，在市场上消费甚广，也有研究丁香、肉桂、柑橘精油，其中含有的脂肪族和芳香族化合物，具有很好地抑制酪氨酸酶的作用，在医疗、抗氧化方面也表现出很大的潜力。[/font][font=宋体]4.2[/font][font=宋体]、白藜芦醇及衍生物[/font][font=宋体]白藜芦醇主要存在于葡萄、虎杖、藜芦等植物中，以浓度依赖性方式抑制黑素细胞的功能及酪氨酸酶的活性，从而减少黑素合成。它还与黑素生成中的酪氨酸酶相关蛋白[酪氨酸相关蛋白（TPR）-1、TPR]及小眼相关转录因子（MITF）有关。并且以浓度依赖方式抑制转录因子的mRNA、蛋白质表达。研究表明外用白藜芦醇可有效地改善肤色，具有一定的美白作用，且无不良反应，安全性好。白藜芦醇具有不稳定、生物利用度差的缺点，研究发现其衍生物(五烷基醚衍生物和四酯衍生物)生物利用度高，能够更好地抑制黑素的合成，在皮肤美白化妆品中具有广阔的应用前景。[/font][font=宋体]4.3[/font][font=宋体]、醛类及其衍生物[/font][font=宋体]醛类及其衍生物主要是羰基与酶中亲核集团，如氨基、羟基、硫基结合形成螯合配体结构即席夫碱结构，产物在活性中心形成空间位阻，阻止底物与活性中心结合，从而抑制酪氨酸酶活性，抑制黑色素的合成。经酶学动力学与方法研究表明2-羟基-4-甲氧基苯甲醛是一种混合型抑制剂，抑制常数K1和K1S分别为为0.131mmol/L和0.253mmol/L。[/font][font=宋体]4.4[/font][font=宋体]、植物多酚类物质[/font][font=宋体]酚类物质主要分布在植物根、茎和果实中，主要为多元酚，是一种次生代谢物，其对美白的作用属于多种效应，包括吸收紫外光、清除自由基、抑制酪氨酸酶活力，来达到美白祛斑的作用。同时植物多酚也具有抗衰老诱变、抗病毒肿瘤等功效。比如苹果、茶树花、藜蒿叶、茶叶等物质中提取的多酚物质均被报道具有清除自由基和调控酪氨酸酶活力的作用。[/font][font=宋体]4.5[/font][font=宋体]、其它[/font][font=宋体]内皮素会刺激黑素细胞增殖、分化，并且激活酪氨酸酶的活性，促进黑色素的生成。从欧洲草本植物洋甘菊中提取内皮素拮抗剂能抑制内皮素，激活酪氨酸酶及促进黑素细胞分化的作用，具有高效性、均匀黑素分布的作用，从而避免色斑的生成。[/font][font=宋体]结语[/font][font=宋体]植物来源的美白原料从单方提取到复方搭配，从多靶点、多方位、多层次寻找安全有效的植物美白活性物，再结合微生物发酵，天然绿色的化妆品原料功效势必会有更多、更大的市场前景。多酚、黄酮类物质可能因为后期灭菌时的高温变性，而丧失了一定的清除自由基的作用。通过改进发酵提取的工艺，保留更多的多酚、黄酮类物质，有望制备出更加安全有效的植物美白剂。[/font][font=宋体]参考文献[/font][font=宋体][1][/font][font=宋体]李溯，丁劲松.黑色素生物合成与酪氨酸酶抑制剂的研究进展[J].中南药学，2013（04）：44-48.[/font][font=宋体][2][/font][font=宋体]王玉林，何锦风，王维民.皮肤黑色素的产生及美白浅析[J].日用化学品科学，2013，36（02）：33-35，49.[/font][font=宋体][3][/font][font=宋体]舒文，毛华明.黑色素的研究进展[J].国外畜牧学（猪与禽），2003（02）：32-35.[/font][font=宋体][4][/font][font=宋体]胡泳华，贾玉龙，陈清西.酪氨酸酶抑制剂的应用研究进展[J].厦门大学学报：自然科学版，2016（55）：768.[/font][font=宋体][5][/font][font=宋体]欧霖拱.天然植物美白活性成分的研究进展[J].福建轻纺，2017（10）：38-43.[/font][font=宋体] [/font]