巯基乙醇

一、蛋白样品制备　　之前和大家介绍过细胞和组织蛋白质的提取，当我们做WB的时候，需要对提取好的蛋白样品进行处理：在蛋白样品中加入SDS loading buffer 6X（蛋白上样缓冲液）稀释至1X（如蛋白样品有120ul，则加入SDS loading buffer 6X 600ul），混匀，75-95度加热10-15分钟，使蛋白变性以充分暴露抗原位点。在加热结束后，进行离心，使蛋白样品适当降温，防止PAGE胶被融化。　　PS：要测量的蛋白如果是磷酸化形式，一般加热到75度，一般情况可95度加热。市面上买到的SDS loading buffer 有2X的也有5X的，最后稀释至1X即可。　　那么为什么我们加入SDS loading buffer呢？主要就是用它的不同成分在电泳中起了关键的作用。　　SDS loading buffer 的主要成分及作用：A：0.1%溴酚蓝，作为指示剂，方便观察电泳进行的程度；B：10%甘油，密度大，增加样本的重量，可携带样本沉到底部；C：2%SDS，是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，按一定比例和蛋白质分子结合成为复合物，是蛋白质带满负电荷，从而是蛋白带电荷一致，减少电荷对电泳结果的影响；D：巯基乙醇还原剂，使蛋白质的二硫键断开，使得蛋白保持线性结构。　　二、蛋白上样　　1. 将之前配好的胶固定在电泳装置上，加入1X电泳液　　2. 拔出梳子，应该两侧同时用力，缓慢拔出，注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使其变形，若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。　　3.加入蛋白样品，一般10孔的梳孔，每孔可以加入20ul -40ul蛋白样品，15孔的梳孔，每孔可以加入10ul -30ul蛋白样品，是用微量注射器加样，平时我们也可以用普通的移液枪加样，尽量让枪头深入梳孔底物，防止蛋白样品飘出，一般在目的蛋白两侧加入等量的marker，如果两侧有空的梳孔，应该加入1X的loading buffer，起“压边”作用，可以使蛋白样品在一条水平线上往下跑。　　4.电泳：接上电极，正负极不要弄反，红色对红色，黑色对黑色，初始电压设为90V，当样品跑至分离胶时将电压调至120V，一般在溴酚蓝跑出胶时停止电泳，也可根据目的蛋白的分子量来选择跑的时间，如分子量较大，可以延长电泳时间，使得分子量大的marker跑的分散开，容易判断分子量。　　三、注意事项　　1.蛋白样品上样量最好相等，不要过多。　　2.不要过多重复使用电泳Buffer　　3.最佳分辨区在分离胶的2/3　　4.电泳后测定的分子量有10%的误差，不可完全信任。有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上的肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链，SDS-PAGE电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量，有的蛋白质（如电荷异常或结构异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质）不能采用该发测相对分子量。　　5.如果电泳中出现拖尾，染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。

自然界物种丰富，其中85%-99.9%的微生物不可培养，面对形形色色的样本类型，不同物种的组织部位、生理生化特性各异，从而增加了DNA提取的难度。MP Biomedicals的SPINeasy家族即将推出2款新品试剂盒，分别应用于水样基因组DNA、组织&细菌基因组DNA提取。采用硅胶膜离心柱法高效结合DNA，可快速安全地提取到高质量DNA，满足该类型样本DNA提取难题。让我们先来一睹为快吧~- SPINeasy DNA Kit for Water -水体是仅次于土壤的第二种微生物天然培养基，通过对水体微生物的种群结构及多样性进行分析并研究其动态变化，可为充分了解水体微生物组成、优化群落结构、 调节群落功能提供非常可靠的依据。水体中微生物种类繁多，数量大，主要来自于土壤、污水、空气及动植物尸体等。因此从水体中抽提的微生物总DNA存在很多抑制因子，如腐殖酸、酚类化合物等，这些物质即使微量存在于纯化后的DNA中也会对下游实验如PCR、限制性酶切等产生影响。SPINeasy DNA Kit for Water专门设计用于从多种水体样本中快速提取基因组DNA。 产品优势：裂解介质E+滤膜更高品质：精选滤膜和大容量裂解介质管确保获得更高浓度DNA，独特的裂解缓冲液，保障更高纯度，提取的DNA可直接应用于下游实验；操作简单：离心柱法提取DNA，快速简单；方便省心：配备滤膜和 5mL裂解介质管，节省额外购买的时间和费用；适应性广：高效提取多种水体样本DNA，适用性广 ；安全环保：不使用酚、氯*仿、ß-巯基乙醇等有毒试剂。 数据展示：SPINeasy DNA Kit for Water适用于多种类型水样样本，能够提取高产量和高纯度的基因组DNA，可直接应用于下游实验。- SPINeasy DNA Kit for Tissue and Bacteria -动物组织、血液、细胞和细菌等是分子生物学技术的常见研究材料，对这些样本的DNA进行分析研究已经广泛应用于功能基因组研究、肿瘤诊断及治疗靶点发现、遗传性疾病鉴定、动物疫病检测、司法鉴定和细菌耐药性等多个领域。组织样本类型多样，包括心、肝、脾、肺、肾、尾巴等，每种组织中所含的细胞数量差别很大，进行DNA提取时的起始量也会有所不同。例如对于肝脏和脾脏等RNA和蛋白质含量高的组织，较少的组织即可获得理想的DNA提取效果。同样，血液样本也因物种的不同，DNA分离方法也略有区别，哺乳动物的成熟红细胞没有细胞核，而鸟类和两栖类动物成熟的红细胞有细胞核，所需的血液量也有区别。SPINeasy DNA Kit for Tissue and Bacteria是一款基于硅胶膜离心柱技术的高性能基因组DNA提取试剂盒，不仅可以从各种动物组织中提取DNA，还能从血液（包括无核红细胞和有核红细胞的血液）、培养细胞和细菌（包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌）中分离基因组DNA，所得基因组DNA可直接用作PCR 模板、酶切、杂交等分子生物学实验。 产品优势：品质保证：优化的裂解缓冲液和漂洗液，保障更高浓度和纯度，提取的DNA可直接应用于下游实验；简便快捷：离心柱法提取DNA且无需添加Protease K，快捷方便，配合精选裂解介质A提取单个样本DNA时间30 mins，节省时间。一盒多用：组织、细菌和血液样本都可使用，无需额外购买多款试剂盒；安全环保：不使用酚、氯*仿、ß-巯基乙醇等有毒试剂。 数据展示： 含裂解介质款SPINeasy DNA Kit for Tissue and Bacteria（With Lysing Matrix），试剂盒内含有裂解介质A，主要针对不同类型难研磨的动物组织样本，30min即可获得高质量的DNA，可用于多种下游实验，另外也可以用于从血液、细胞和细菌中提取DNA，操作更加简单、快捷。 无裂解介质款SPINeasy DNA Kit for Tissue and Bacteria（Without Lysing Matrix），采用液氮研磨和加热孵育的方式裂解样品后，提取不同类型组织、血液和细菌DNA，可直接应用于下游实验。

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