电损伤仪

中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学国家重点实验室汪海林课题组在DNA损伤研究方面取得了一系列重要进展。　　DNA损伤是诱发基因突变、癌症发生和发育畸形的关键因素。由于缺少快速、高通量、广谱的筛选与鉴定手段，数目众多的化学品缺乏DNA损伤的毒性数据。研究人员利用敲除特定抗氧化基因的大肠杆菌增强对DNA损伤的敏感性，发展出一种广谱的细菌传感器，可快速、灵敏地筛选与鉴定过去难以检测的DNA损伤试剂如丙烯醛、卤代苯醌等，显著地拓展了检测范围。该项工作发表在美国化学会期刊Anal. Chem.上(2011, DOI/10.1021/ac200426x)。　　近年来，他们发展了一种新颖的DNA缠绕分析方法，在此基础上，进一步揭示了修复酶可识别多种化学结构不同的损伤的机制，从而在DNA修复机制方面取得重要突破，有助于发展有效的癌症预防和治疗措施。该项成果发表在国际著名的综合性期刊Proc. Natl. Acad. Sci. USA( 2009, 106,12849)上。　　在DNA加合物分析方面，他们发展的苯并(a)芘加合物分析新方法检测灵敏度可达6.6 × 10-21mol，比经典的32P放射性后标记方法提高了5400倍(Anal. Chem., 2009, 81, 10285)。这一方法的发展有望解决长期缺乏测定人体痕量加合物的高灵敏分析技术的难题。另外，研究人员还发展了新颖的DNA甲基化分析(Anal. Chem. 2009, 81, 7885)、金属调节-核酸电泳分离分析(Anal. Chem., 2010, 82, 487)以及荧光粒子计数免疫法(Anal. Chem., 2010, 82, 9901)。　　这些前沿性的工作是在他们独立研制的先进的毛细管电泳-激光诱导荧光偏振检测装置上开展的。现已形成一个较为系统的DNA修饰评价体系，预期在环境与健康、癌症诊断与治疗等领域具有重要的研究和实际应用价值。　　这一系列工作得到国家自然科学基金、中科院“百人计划”择优项目、中科院重大装备研制项目及环境化学与生态毒理学国家重点实验室基金等的支持。　　图1 独立研制的毛细管电泳-激光诱导荧光偏振检测装置　　图2 DNA缠绕-局部解链模型

生物体在正常生命过程中会面临内/外因来源的DNA损伤，DNA损伤不仅影响基因的正确复制，也阻碍其正常转录。为避免DNA损伤带来的灾难性后果，生物体进化出一整套修复机制，以保证复制和转录的正确性、基因组的完整性和遗传的稳定性。常见的修复方式有光激活修复系统、错配修复、剪切修复、同源重组修复等。值得注意的是，基因转录过程也是独特的DNA损伤修复机制。多亚基蛋白复合体RNA聚合酶（RNA polymerase，RNAP）是完成基本生命活动的一员“大将”，保守存在于细菌、古细菌、真核生物中，负责转录合成各类RNA，其核心酶发挥主要的合成作用。细菌RNAP核心酶结构最为简单，古细菌核心酶与真核生物RNAPⅡ有显著的结构保守性。真核生物中的RNAPⅠ、RNAPⅡ、RNAPⅢ核心酶结构具有同源性，但分别发挥不同的功能，其中RNAPⅡ负责转录所有编码蛋白的基因和许多非编码RNA。转录过程中，RNAP沿模板链的行进路途并非一帆风顺，基因组DNA总是不可避免的遭受内外环境带来的损伤。转录模板链上的DNA损伤，如单链断裂、双链断裂等会阻碍RNAP在模板链上的正常前行[1]。研究发现，当转录中的DNA双链产生诱变损伤时，转录模板链的修复程度要高于编码链，模板链的修复比编码链修复更快，而编码链的修复与基因组DNA的修复节奏基本一致，这说明转录中优先修复模板链中的DNA损伤[2]。RNAP沿模板DNA转录过程中，会感知DNA损伤，并招募修复蛋白，继而修复损伤DNA[3]，此过程称为RNAP监视（RNA polymerase-surveilled，RNAP-S）的DNA修复。RNAP在参与转录过程中受到阻碍RNAPⅡ在感知DNA损伤时，不与受损的碱基直接发生作用，而是感知其转录发生障碍后引起的空间位阻。RNAPⅡ结构中的桥螺旋（bridge helix，BH）负责连接RNAPⅡ的两个部分，将RNAPⅡ催化位点与下游的主、次要通道分开，模板装载中越过BH的步骤可作为RNAP变位的检验点。RNAPⅡ装载DNA模板时，DNA下游模板需要越过桥螺旋才能到达活性位点添加NTPs以进行正常转录，此跨越步骤需要模板链发生显著的构象变化。但存在大规模损伤的DNA链往往由于受损的碱基与RNAPⅡ桥螺旋结构上方相结合，而不能发生正常的构象变化，RNAPⅡ无法正常装载DNA模板链，变位步骤受到阻碍，因此发生滞留现象。RNAP监视下的修复策略单枪匹马——当遇到较小的损伤如CPD、AP、Gh时，RNAPⅡ虽然受到阻碍，但不足以被滞留。在这种状态下，RNAPⅡ缓慢的经过损伤位点，并发生不依赖于模板的AMP优先的碱基错误掺入，导致转录产物mRNA中相对损伤的位点的突变，这种易错的修复方式被称为A规则。团队协作——RNAP因DNA损伤滞留在DNA模板链上时，会被转录偶联修复因子识别，此时RNAP从模板解离、回溯变位、降解，并引发后续修复蛋白的组装和修复。例如，细菌中转录偶联因子Mfd，它可以解离模板链上较强损伤处的RNAP同时引发核苷酸切除修过程。有趣的是，它也能促进较弱损伤处RNAP的变位而跨越损伤，Mfd与非NER因子共同作用，以易错的方式修复DNA损伤。原核生物中的DskA也以类似Mfd的方式使DNA损伤处的RNAP发生解离，DNA模板上的损伤进而被修复[7]。Mfd的真核生物同源蛋白CSB同样实施RNAP-S修复，其过程受到更多因素的调控。原核生物NER系统修复因子之一的Uvrd能直接使滞留的RNAP发生回溯，暴露的损伤部分进而能被修复蛋白修复[9]。真核生物中的OGG1也可引发RNAP-S-BER修复。此外，也有研究显示，RNAPⅢ在同源重组介导的DNA双链断裂修复中发挥了关键的作用。RNAPⅡ监视下的修复策略RNAP-S偶联DNA修复的生物学意义确保基因组的稳定——RNA-S修复对基因组稳定性的维持有重要作用。RNAP在模板DNA损伤处的长期停滞会导致错误碱基掺入，从而导致RNAP-S修复的失败，而基因组不稳定将威胁细胞的存活。但在营养胁迫下发生的易错方式的修复引入的突变却提高了遗传多样性，有利于细胞逃离限制生长的条件，增强了细胞对环境的适应能力。防御疾病——RNAP-S修复影响生物体对癌症的预防。例如与RNAP-S修复缺陷相关的柯凯因氏综合征（Cockayne Syndrome，CS）、紫外线敏感综合征（UV-sensitive Syndrome，UVSS）。这两种疾病都是由于相关基因的突变导致RNAP-S-NER缺陷而引起。此外，视网膜退行性疾病、范可尼贫血症、肺癌、亨廷顿氏病症等疾病也与RNAP-S修复途径受损有关。展 望目前人们已经较深入的了解了DNA损伤修复，并揭示了多种DNA损伤修复途径。然而在RNAP监视的DNA修复中，很多机制仍有待于研究。尤其是真核细胞RNAP-S途径的很多细节尚不清楚。但相信随着分子生物学技术手段的革新，这些问题可以被回答。或许在不久的将来我们也可以靶向抑制或加强RNAP-S修复系统来治疗人类不同疾病。

香蕉是中国岭南特色水果之一，香蕉在采收和运送过程中往往处于绿硬期(青香蕉),在此过程中易受到各种碰撞损伤。不同类型碰伤均可加速香蕉果皮活性氧的积累进而导致香蕉果实的衰老腐败 青香蕉受到碰撞损伤后，微生物容易侵染损伤部位，经过催熟过程中的乙烯释放和果实软化后，造成於伤腐烂或黑斑花脸，严重影响其色泽品质和销售价格。因此，亟待寻找一种快速无损检测青香蕉碰撞损伤的方法。为探究有效检测青香蕉早期轻微碰撞损伤的方法，本文结合青香蕉的结构特点利用高光谱技术找出青香蕉关于碰撞损伤特性的特征波长段，实现碰伤程度的区分与可视化。研究为开发青香蕉表面碰伤快速无损检测系统，提高香蕉经济效益具有重要意义。1.材料与方法1.1青香蕉碰撞损伤程度分类青香蕉的品质分级标准14中，果身表面的机械类损伤面积是一个重要指标。标准规定，果身表面无碰压伤的青香蕉属于优等品；碰压伤面积小于1cm² 的属于一等品；碰压伤面积为1～2 cm² 的属于二等品；碰压伤面积大于2cm² ,属于劣等品将不进入市场。将碰伤的香蕉置于温度15℃、相对湿度88%的恒温恒湿环境中保存48 h取出切开，损伤面积如表所示。1.2 高光谱图像采集系统试验可采用彩谱科技有限公司的高光谱成像仪，主要包括高光谱相机、光源、载物台、滑轨、计算机控制硬件和软件系统。光源采用仪器自带的卤素灯，光谱仪的光谱范围为400～1000 nm,采样间隔为2.39 nm,将光谱范围分为256个频带范围。仪器扫描的具体参数设置：曝光时间20 ms,移动台前进速度1.4 cm/s,回退速度2cm/s,镜头与样本距离42 cm。本研究使用的光谱数据由256维图像组成。区别于三维的RGB图像，高光谱图像的数据信息高维且冗余，如果对每份样品的所有图像进行处理，不仅工作量庞大且后续的建模效果不佳。如图所示是同一份样品在不同波段下(500、600、700、800nm)的图像，对比可知：不同波段下的图像其呈现出的碰伤情况存在差异。因此探究青香蕉关于碰撞损伤的特征波段，利用特征波段下的图像提取碰伤部位的光谱数据，可为后续的检测模型提供可靠且精准的数据集。2结果与分析2.1 原始光谱数据预处理结果使用软件进行预处理，首先对原始光谱进行多项式平滑法处理，再采用多元散射校正法对光谱进行预处理，以降低极限漂移和散射效应。对原始样本数据集如图a先进行SG处理，将处理后的光谱曲线再进行多元散射校正法处理。处理后的效果如图b所示。可以看出，预处理后的光谱曲线修正了部分反射率为1的数据，总体曲线更加归一且平滑，噪音点减少，曲线的凹凸处变少。说明该预处理方法效果较好，后续研究所用的光谱数据皆为经过SG和MSC方法预处理后的数据。2.2基于BP神经网络的检测模型和可视化碰伤等级图像通过图像分割流程，将918张灰度图像进图像分割，提取香蕉碰伤部位的轮廓区域，同时利用图像全像素点下的反射率数据，用光谱反射率数据去表示碰伤轮廓区域的每个像素点所代表的信息。对健康样品、轻度碰撞伤样品、中度碰撞伤样品、重度碰撞伤样品的测试集的识别准确率分别为97.53%、92.59%、93.82%和96.29%,平均碰伤程度的判断准确率为95.06%。为了更好地展示分类结果，同时考虑检测的可视化，对每一个像素点用“00”代表健康，标记为黄色RGB(255,255,0) “01”代表轻度碰撞伤，标记为蓝色RGB(67,142,219) “10”代表中度碰撞伤，标记为紫色RGB(128,0,128) “11”代表重度碰撞伤，标记为红色RGB(255,0,0)的方式进行最后的输出显示。其中区域的总体识别结果若有85%以上的相同数值和颜色，那么本区域都用此数值和颜色进行归一显示，最后的可视化图像如图所示。3.结 论本文以青香蕉为研究对象，利用高光谱成像仪采集青香蕉健康表面和不同碰伤程度香蕉的光谱反射率数据和不同波段下的图像信息，结合特征变量筛选对青香蕉的碰撞损伤程度进行了研究，主要结论如下：1)采用3种类型的支持向量机算法，验证了青香蕉碰撞损伤的识别机理以及采用光谱数据和图像信息结合进行无损检测的合理性。2)对通过预处理和异常样本剔除后的数据进行特征波长提取和验证，得到9段特征波长。3)通过获取特征波长段下的图像，提取碰撞损伤区域的轮廓分布边界数据以及该区域的每个像素点对应的光谱反射率数据。将此数据作为BP神经网络的输入层进行训练，最后得到的模型对健康样品、轻度碰撞伤样品、中度碰撞伤样品、重度碰撞伤样品的测试集识别准确率为97.53%、92.59%、93.82%和96.29%。