小鼠椎间盘纤维环细胞

本司产品仅用于科研，不用于临床诊断和治疗

1.产品名称：小鼠椎间盘纤维环细胞

2.组织来源：椎间盘组织

3.产品规格：5×105cells/T25细胞培养瓶

培养信息：

培养基 含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

产品货号 CM-M204

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 梭形、多角形

传代特性 可传3-5代左右

消化液 0.25%胰蛋白酶

培养条件 气相：空气，95%；CO2，5%

4.细胞简介：

小鼠椎间盘纤维环细胞分离自椎间盘组织；椎间盘是位于脊柱两椎体之间，由软骨板、纤维环、髓核组成的一个密封体。上下有软骨板，是透明软骨复盖于椎体上，下面骺环中间的骨面。上下的软骨板与纤维环一起将髓核密封起来。纤维环由胶原纤维束的纤维软骨构成，位于髓核的四周。纤维环的纤维束相互斜行交叉重叠，使纤维环成为坚实的组织，能承受较大的弯曲和扭转负荷。纤维环的前侧及两侧较厚，而后侧较薄。纤维环的前部有强大的前纵韧带，后侧的后纵韧带较窄、较薄。纤维环细胞密度为9000个细胞/mm3，其外层的细胞呈梭型，主要属于纤维细胞，内层细胞呈圆形，主要属于软骨细胞。在培养的情况下，用透射电镜观察则有许多共同的超微结构表现，它们的核较圆，核仁较明显。细胞质内可见大量的附有核糖体颗粒的粗面内质网和滑面内质网。细胞质内线粒体多，为椭圆形，有的可看到双层单位膜，由单位膜包绕初级深酶体和次级深酶体。细胞质内有一系列的扁平囊及小泡主成的高尔基复合体和分泌颗粒，纤维环细胞合成分泌蛋白多糖及胶原纤维的能力很旺盛，保证纤维环生理代谢活动所需的构造物质的供给。一但这种供给减少，纤维环的生物性能就会减弱，椎间盘开始退变。

意事项如下：

（1）无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强对无菌操作的观念，以预防为主，一旦污染，通常难以消除。

（2）培养基：所使用的培养基必须满足细胞存活和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养基的要求也会有一定差异，必要时可通过预实验选择适宜的培养基。

（3）小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的存活和促进细胞增殖起着至关重要的作用。可以选择多个不同批次的小牛血清进行小样分析。一旦确定了某一厂家某一批次的小牛血清，就应坚持使用至实验结束。

（4）胶原酶溶液：必须新鲜配制，贮存时间过长（即使是低温保存在-20℃），也会影响消化效力，导致消化时间过长，增加细胞损伤。

（5）L-谷氨酰胺：几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高的需求，细胞需要谷氨酰胺来合成核酸和蛋白质，缺乏谷氨酰胺会导致细胞生长不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中不太稳定，在4℃冰箱贮存两周以上时，应重新加入相同量的谷氨酰胺。

（6）静置培养：原代细胞在消化分离后，放置于CO2培养箱的前24～48h（必要时达到72小时）内，应处于绝对静止状态，切忌频繁取出培养瓶观察生长情况，这会使原代分离细胞难以附着于壁面，更谈不上伸展和增殖。

（7）消化时间：通常消化至肉眼可见微小组织颗粒即可，因为此时组织颗粒已松散，稍加吹打即可形成细胞团或单个细胞，过长的消化时间往往导致细胞损伤加重，细胞培养成活率降低。

（8）其他生长因子：经过以上处理，一般原代分离细胞培养都可以成功。对于少数特殊类型的细胞，也可以考虑添加一些特殊的生长因子，例如胰岛素可以促进细胞对葡萄糖和氨基酸的摄取。此外，内毒素、EGF、FGF等也具有促进有丝分裂的作用，但费用较高。

原代细胞培养具体步骤如下：

1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3、处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2-3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30-60分钟。

4、剪切：用眼科剪把组织切成2-3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30-50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

5、消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

6、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500-1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2-7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

8、培养：置于37℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。

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