甲型流感（禽流感）病毒H5N2亚型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

产品名称：甲型流感（禽流感）病毒H5N2亚型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

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本产品就是根据PCR原理专门开发的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。

2. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

3. 产品精心优化且特异性高，引物是根据高度保守区设计，不会跟除此之外的其它微生物DNA发生交叉反应。

4. PCR mix中含上样染料，PCR后可以直接上样电泳。

5. 本产品足够50次20μL体系的PCR反应。

6. 本产品只能用于定性实验，不能用于定量。

7. 本产品只能用于科研

甲型流感（禽流感）病毒H5N2亚型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒操作过程：

一、样品采集：

1、食品样品：样品的采集与预培养按照样品的采集与预培养按照《食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验要求进行。

2、血液样品：用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL，注入无菌EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管，立即混匀。

3、粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。

4、病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。

一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）

1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。

2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（用带芯枪头，下同）。

4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

注：上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。

二、DNA提取：

可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。

1、液体培养物：取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中，8000rpm离心3min，尽量吸弃上清，加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。

2、固体培养物：挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。

3、粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。

4、其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。

甲型流感（禽流感）病毒H5N2亚型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒样本采集、存放及运输：

1、样本采集：各类型样本按照常规方法采集；

2、运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限一年。阳性对照需单独放置，不要污染其他试剂。

3、运输：采用泡沫箱加冰密封进行运输。

4、自备试剂：样品DNA。

甲型流感（禽流感）病毒H5N2亚型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒注意事项

1所有操作严格按照说明书进行；

2试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

3反应液应避光保存；

4反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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